معلومة

لماذا تميل البروتينات المشوهة إلى أن تكون أقل قابلية للذوبان من البروتين الأصلي؟

لماذا تميل البروتينات المشوهة إلى أن تكون أقل قابلية للذوبان من البروتين الأصلي؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لماذا تميل البروتينات المشوهة إلى أن تكون أقل قابلية للذوبان من البروتين الأصلي؟ من حيث التأثيرات الكارهة للماء ، هل يمكن لأي شخص أن يفسر لي هذه الظاهرة؟


معلومات اساسية

يحتوي البروتين الأصلي على أحماض أمينية كارهة للماء مطوية إلى الداخل ، لذلك فهو ذو قلب كاره للماء. لماذا ا؟ لأنه يفضل الديناميكا الحرارية. عندما يتم تغيير طبيعة البروتين ، لن تكون الأحماض الأمينية الكارهة للماء أطول داخل لب البروتين ، ولكن بدلاً من ذلك ستتعرض للبيئة المحبة للماء (بافتراض أنك تتحدث عن بروتين داخل كائن حي). لكن هذا ليس مفضلاً من الناحية الديناميكية الحرارية لأن الأجزاء الكارهة للماء لا يمكنها تكوين روابط H مع الماء وبالتالي فهي غير قابلة للذوبان كثيرًا في الماء:

لذلك عندما يحدث هذا ، فإن العديد من جزيئات البروتين سوف تتجمع مثل مذيلات الصابون (لأن التفاعلات الكارهة للماء مفضلة). سيؤدي ذلك إلى خفض المساحة السطحية الإجمالية للأحماض الأمينية الكارهة للماء الملامسة للماء ، وبالتالي تقليل الاضطراب في الترابط H في جزيئات الماء.

هذا هو تصويري الذاتي لتأثير جزيء المواد العضوية على الترابط H في الماء (إنه قاسي للغاية ، لذلك لا تهتم بالتفاصيل الدقيقة).

تلخيص ستتعرض الأحماض الأمينية الكارهة للماء للبيئة المحبة للماء -> ستتجمع البروتينات معًا -> البلاك غير القابل للذوبان.


تمسخ (الكيمياء الحيوية)

تمسخ هي عملية تفقد فيها البروتينات أو الأحماض النووية البنية الرباعية ، والبنية الثلاثية ، والبنية الثانوية الموجودة في حالتها الأصلية ، عن طريق تطبيق بعض الإجهاد الخارجي أو المركب مثل حمض أو قاعدة قوية ، ملح غير عضوي مركّز ، مذيب عضوي (على سبيل المثال ، كحول أو كلوروفورم) ، إشعاع أو حرارة. [3] إذا تم تغيير طبيعة البروتينات الموجودة في الخلية الحية ، فإن هذا يؤدي إلى تعطيل نشاط الخلية وربما موت الخلية. كما أن تمسخ البروتين هو نتيجة لموت الخلية. [4] [5] يمكن للبروتينات المُحوّلة أن تُظهر مجموعة واسعة من الخصائص ، من التغيير التوافقي وفقدان القابلية للذوبان إلى التجميع بسبب تعرض المجموعات الكارهة للماء. تفقد البروتينات المشوهة هيكلها ثلاثي الأبعاد وبالتالي لا يمكنها العمل.

ملاحظة 1: معدل من التعريف الوارد في المرجع. [1]

ملاحظة 2: يمكن أن يحدث التمسخ عندما تتعرض البروتينات والأحماض النووية لدرجات حرارة مرتفعة أو درجات حموضة قصوى ، أو لتركيزات غير فسيولوجية من الملح أو المذيبات العضوية أو اليوريا أو عوامل كيميائية أخرى.

ملاحظة 3: ان إنزيم يفقد نشاطه التحفيزي عندما يتحول إلى طبيعته. [2]

يعد طي البروتين مفتاحًا لمعرفة ما إذا كان البروتين الكروي أو الغشائي يمكنه أداء وظيفته بشكل صحيح ، يجب طيه بالشكل الصحيح ليعمل. ومع ذلك ، فإن الروابط الهيدروجينية ، التي تلعب دورًا كبيرًا في الطي ، ضعيفة نوعًا ما وبالتالي تتأثر بسهولة بالحرارة والحموضة وتراكيز الملح المتغيرة وغيرها من الضغوطات التي يمكن أن تفسد البروتين. هذا هو أحد الأسباب التي تجعل التوازن ضروريًا من الناحية الفسيولوجية في العديد من أشكال الحياة.

هذا المفهوم لا علاقة له بالكحول المشوه ، وهو الكحول الذي تم خلطه مع المواد المضافة لجعله غير مناسب للاستهلاك البشري.


استجابة البروتين غير المطوية والإجهاد الخلوي ، الجزء ب

Daisuke Oikawa، Yukio Kimata، in Methods in Enzymology، 2011

4.3 في المختبر المقايسة المضادة للتجميع

تم استخدام ركائز البروتين المحوّلة الصفات النموذجية ، لوسيفيراز (بروميغا) وسينثاز السترات (روش). تم غسيل سينسيز السيترات مقابل المخزن المؤقت للمخزون (20 مم حبيس (درجة الحموضة 7.0) ، 150 مم بوكل ، 2 مم MgCl2، و 10٪ (حجم / حجم) جلسرين) ، ويتم تخزينها عند - 80 درجة مئوية. لتغيير طبيعة لوسيفيراز (25 ميكرولترم التركيز النهائي) وسينثاز السترات (50 ميكرولترم التركيز النهائي) في محلول تغيير طبيعة غوانيدين حمض الهيدروكلوريك (جوانيدين- حمض الهيدروكلوريك (6 م للوسيفيراز أو 4 م لتخليق السترات) ، 20 مم حبيس (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، 50 مم بوكل ، و 2 مم MgCl2) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك تخفيف مخاليط البروتين المشوه (تخفيف 50 ضعفًا للوسيفيراز أو تخفيف 33 ضعفًا لتصنيع السيترات) مع محلول الفحص (20 مترًا).م حبيس (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، 50 مم بوكل ، و 2 مم MgCl2) في وجود أو عدم وجود بروتينات الاختبار المؤتلفة. تمت مراقبة تراكم البروتين بعد التخفيف عن طريق الامتصاص البصري عند 320 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (DU640 Beckman Coulter) عند درجة حرارة الغرفة.


علم تمسخ البروتين بالحرارة

تعتبر التغييرات الرئيسية في الهياكل الثانوية والثالثية والرباعية دون انقسام روابط الببتيد الفقري "تمسخ". عادةً ما يُنظر إلى التغييرات الطفيفة في البنية ، والتي لا تغير بشكل جذري البنية الجزيئية للبروتين "التكيف التوافقي". انهيار روابط الببتيد للبروتين إلى ببتيدات أو أحماض أمينية هو "الهضم"

تعتمد بنية البروتين على تفاعلات جذابة ومثيرة للاشمئزاز ناتجة عن قوى جزيئية مختلفة بالإضافة إلى تفاعل مجموعات البروتين المختلفة مع مياه المذيبات المحيطة. الحالة الأصلية (لجزيء بروتين واحد) هي الأكثر ثباتًا من الناحية الديناميكية الحرارية مع أقل طاقة مجانية ممكنة في الظروف الفسيولوجية. أي تغيير في بيئته ، مثل الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية ودرجة الحرارة وتكوين المذيب وما إلى ذلك ، سيجبر الجزيء على افتراض بنية توازن جديدة.

فهم بنية البروتين

كيف نقيس تمسخ البروتين

ينطوي التمسخ على تحويل بنية البروتين المطوية المحددة جيدًا ، والتي تشكلت في ظل ظروف فسيولوجية ، إلى حالة غير مطوية في ظل ظروف غير فسيولوجية. كما نعلم ، لا يمكننا قياس البنية بشكل مباشر ، أي أن القياس المباشر لكسور البروتين الأصلي والمتشوه في المحلول غير ممكن. لكن التغييرات التوافقية في البروتينات تؤثر دائمًا على العديد من خواصها الكيميائية والفيزيائية ، مثل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، التألق ، اللزوجة ، معامل الترسيب ، الدوران البصري ، ازدواج اللون الدائري ، تفاعل مجموعات السلفهيدريل ، ونشاط الإنزيم. وبالتالي ، يمكن دراسة تمسخ البروتين من خلال مراقبة التغيرات في هذه الخصائص الفيزيائية والكيميائية.

الحرارة كمحول

الحرارة هي العامل الأكثر استخدامًا في معالجة الأطعمة وحفظها. عندما يتم تسخين محلول بروتيني تدريجيًا فوق درجة حرارة حرجة ، فإنه يخضع لانتقال حاد من الحالة الأصلية إلى الحالة المشوهة. تُعرف درجة الحرارة عند نقطة المنتصف الانتقالية ، حيث تكون نسبة تركيز الحالات الأصلية والمتحوّلة هي 1 ، إما بدرجة حرارة الانصهار Tm ، أو درجة حرارة التمسخ Td.

آلية التمسخ الناتج عن درجة الحرارة معقد للغاية وينطوي في المقام الأول على زعزعة استقرار التفاعلات الرئيسية غير التساهمية. تعتبر الروابط الهيدروجينية ، والتفاعلات الكهروستاتيكية ، وتفاعلات فان دير فالس طاردة للحرارة (مدفوعة بالمحتوى الحراري) في الطبيعة. لذلك ، يتم زعزعة استقرارها في درجات حرارة عالية واستقرارها في درجات حرارة منخفضة. ومع ذلك ، نظرًا لأن روابط الببتيد الهيدروجينية في البروتينات مدفونة في الغالب في الداخل ، فإنها تظل مستقرة على نطاق واسع من درجات الحرارة. من ناحية أخرى ، فإن التفاعلات الكارهة للماء ماصة للحرارة (مدفوعة بالانتروبيا). يتم تثبيتها في درجات حرارة عالية وعدم استقرارها في درجات الحرارة المنخفضة. لذلك ، مع زيادة درجة الحرارة ، فإن التغييرات في ثبات هاتين المجموعتين من التفاعلات غير التساهمية تتعارض مع بعضها البعض. ومع ذلك ، لا يمكن أن يزيد استقرار التفاعلات الكارهة للماء بشكل لا نهائي مع زيادة درجة الحرارة ، لأنه فوق درجة حرارة معينة ، سيؤدي الانهيار التدريجي لهيكل الماء في النهاية إلى زعزعة التفاعلات الكارهة للماء أيضًا. تصل قوة التفاعلات الكارهة للماء بحد أقصى حوالي 60-70 درجة مئوية.

القوة الرئيسية الأخرى التي تؤثر على الاستقرار التوافقي للبروتينات هي الانتروبيا التوافقية ، & # 8211تي دسConf ، من سلسلة عديد الببتيد. مع زيادة درجة الحرارة ، فإن الزيادة في الطاقة الحركية الحرارية لسلسلة البولي ببتيد تسهل بشكل كبير كشف سلسلة البولي ببتيد.

تمسخ البروتين وتكوين الأحماض الأمينية
يعتمد تمسخ البروتين بالحرارة أيضًا على تكوين الأحماض الأمينية للبروتينات. تميل البروتينات التي تحتوي على نسبة أكبر من بقايا الأحماض الأمينية الكارهة للماء ، وخاصة Val و Ile و Leu و Phe ، إلى أن تكون أكثر استقرارًا من البروتينات الأكثر مقاومة للماء. تحتوي بروتينات الكائنات المحبة للحرارة عادةً على كميات كبيرة من بقايا الأحماض الأمينية الكارهة للماء. ويقال أيضًا أن عوامل أخرى ، مثل روابط ثاني كبريتيد ووجود جسور ملح مدفونة في شقوق كارهة للماء ، قد تساهم أيضًا في الاستقرار الحراري.

تمسخ البروتين ومحتوى الماء
تسهل المياه بشكل كبير تمسخ البروتينات الحرارية [37،95]. مساحيق البروتين الجافة مستقرة للغاية في حالة تمسخها الحراري. قيمة ال تيينخفض ​​د بسرعة مع زيادة محتوى الماء من 0 إلى 0.35 جرام ماء / جرام بروتين. يرتبط تأثير الماء على الثبات الحراري بشكل أساسي بديناميات البروتين. في الحالة الجافة ، يكون للبروتينات بنية ثابتة ، أي أن حركة مقاطع البولي ببتيد مقيدة. مع زيادة محتوى الماء ، يتسبب الترطيب والاختراق الجزئي للماء في التجاويف السطحية في تورم البروتين. يزيد تورم البروتين من حركة السلسلة ومرونتها ، ويفترض جزيء البروتين بنية منصهرة أكثر ديناميكية. عند تسخينه ، يوفر هذا الهيكل الديناميكي المرن وصولاً أكبر للمياه إلى جسور الملح وروابط الهيدروجين الببتيدية أكثر مما هو ممكن في الحالة الجافة ، مما يؤدي إلى انخفاض تيد.

البرد الناجم عن التمسخ
يقال أنه كلما انخفضت درجة الحرارة ، زاد استقرار البروتين. هناك استثناءات لهذه القاعدة. تلك البروتينات التي تهيمن فيها التفاعلات القطبية على التفاعلات غير القطبية تكون أكثر استقرارًا عند درجات حرارة التبريد أو أقل منها في درجات الحرارة المرتفعة. من ناحية أخرى ، فإن البروتينات التي يتم تثبيتها بشكل أساسي عن طريق التفاعلات الكارهة للماء تكون أكثر ثباتًا عند درجة حرارة الغرفة تقريبًا مما هي عليه في درجة حرارة التبريد.

  • يزداد استقرار الليزوزيم مع انخفاض درجة الحرارة ، في حين أن ثبات الميوغلوبين والعاثية الطافرة T4 الليزوزيم يظهران أقصى استقرار عند حوالي 30 درجة مئوية و 12.5 درجة مئوية ، على التوالي. تحت درجات الحرارة هذه وفوقها ، يكون الميوغلوبين والليزوزيم T4 أقل استقرارًا. عند تخزينهما في درجة حرارة أقل من 0 درجة مئوية ، يخضع هذان البروتينان الناجم عن البرد التمسخ.
  • عندما يتم تخزين الحليب الخالي من الدسم عند 4 درجات مئوية ، ينفصل الكازين ب عن مذيلات الكازين ، وهذا يغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمذيلات.

يمكن عكس طبيعة البروتين.
عندما تتم إزالة المُمْسِط من محلول البروتين (أو يتم تبريد العينة) ، فإن معظم البروتينات الأحادية (في حالة عدم وجود تجميع) يتم إعادة تشكيلها لتشكلها الأصلي في ظل ظروف المحلول المناسبة ، مثل الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية وإمكانات الأكسدة والاختزال وتركيز البروتين .

  • الجلايسينين ، أحد بروتينات تخزين فول الصويا ، يتراكم ويترسب عند تخزينه عند 2 درجة مئوية ، ثم يصبح قابل للذوبان عند إعادته إلى درجة الحرارة المحيطة.
  • عدة إنزيمات قليلة القسيمات ، مثل نازعة هيدروجين اللاكتات و نازعة هيدروجين فوسفات الغليسيرالدهيد، تفقد معظم نشاطها الإنزيمي عند تخزينها عند 4 درجات مئوية ، ويعزى ذلك إلى تفكك الوحدات الفرعية. ومع ذلك ، عند تسخينها وتخزينها في درجة حرارة محيطة لبضع ساعات ، فإنها تعيد الارتباط وتستعيد نشاطها تمامًا
  • التمسخ الحراري للبروتينات الكروية الأحادية يمكن عكسها في الغالب. على سبيل المثال ، عندما يتم تسخين العديد من الإنزيمات الأحادية فوق درجات حرارة تمسخها ، أو حتى الاحتفاظ بها لفترة وجيزة عند 100 درجة مئوية ، ثم يتم تبريدها على الفور إلى درجة حرارة الغرفة ، فإنها تستعيد أنشطتها بالكامل. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح التمسخ الحراري غير قابل للانعكاس عند تسخين البروتين عند 90-100 درجة مئوية لفترة طويلة حتى عند درجة الحموضة المتعادلة. تحدث هذه اللارجعة بسبب العديد من التغييرات الكيميائية في البروتين ، مثل إزالة بقايا Asn ، وانقسام روابط الببتيد في بقايا Asp ، وتدمير Cys وبقايا السيستين ، والتجميع.

محاضرة مقترحة عن تمسخ البروتين

المرجعي : كيمياء الأغذية 1996 l 3rd Ed l By O R Fennema l Marcel Dekker


لماذا تميل البروتينات المشوهة إلى أن تكون أقل قابلية للذوبان من البروتين الأصلي؟ - مادة الاحياء

البروتينات عبارة عن بوليمرات من الأحماض الأمينية. يوجد عشرين نوعًا مختلفًا من الأحماض الأمينية بشكل طبيعي في البروتينات. تختلف البروتينات عن بعضها البعض وفقًا لنوع وعدد وتسلسل الأحماض الأمينية التي تشكل العمود الفقري متعدد الببتيد. نتيجة لذلك ، لديهم هياكل جزيئية مختلفة ، وصفات غذائية وخصائص فيزيوكيميائية. البروتينات هي مكونات مهمة للأغذية لعدد من الأسباب المختلفة. إنها مصدر رئيسي للطاقة ، بالإضافة إلى أنها تحتوي على أحماض أمينية أساسية ، مثل ليسين ، تريبتوفان ، ميثيونين ، ليسين ، إيزولوسين وفالين ، وهي ضرورية لصحة الإنسان ، لكن الجسم لا يستطيع تصنيعها. البروتينات هي أيضًا المكونات الهيكلية الرئيسية للعديد من الأطعمة الطبيعية ، وغالبًا ما تحدد قوامها العام ، على سبيل المثال ، طراوة اللحوم أو منتجات الأسماك. غالبًا ما تستخدم البروتينات المعزولة في الأطعمة كمكونات بسبب خصائصها الوظيفية الفريدة ، أي قدرتها على توفير المظهر أو الملمس أو الثبات المرغوب فيه. عادة ، يتم استخدام البروتينات كعوامل هلامية ومستحلبات وعوامل رغوة ومكثفات. العديد من البروتينات الغذائية عبارة عن إنزيمات قادرة على تعزيز معدل تفاعلات كيميائية حيوية معينة. يمكن أن يكون لهذه التفاعلات تأثير إيجابي أو ضار على الخصائص العامة للأطعمة. يهتم محللو الأغذية بمعرفة التركيز الكلي والنوع والبنية الجزيئية والخصائص الوظيفية للبروتينات في الأطعمة.

6.2 تحديد تركيز البروتين الكلي

تم تطوير طريقة Kjeldahl في عام 1883 من قبل صانع الجعة المسمى Johann Kjeldahl. يتم هضم الطعام بحمض قوي بحيث يطلق النيتروجين الذي يمكن تحديده بتقنية معايرة مناسبة. ثم يتم حساب كمية البروتين الموجودة من تركيز النيتروجين في الطعام. لا يزال النهج الأساسي نفسه مستخدمًا حتى اليوم ، على الرغم من إجراء عدد من التحسينات لتسريع العملية والحصول على قياسات أكثر دقة. عادة ما تعتبر الطريقة القياسية لتحديد تركيز البروتين. نظرًا لأن طريقة Kjeldahl لا تقيس محتوى البروتين مباشرة ، فإن عامل التحويل (F) ضروري لتحويل تركيز النيتروجين المقاس إلى تركيز بروتين. يتم استخدام عامل تحويل قدره 6.25 (ما يعادل 0.16 جم نيتروجين لكل جرام من البروتين) في العديد من التطبيقات ، ومع ذلك ، فهذه ليست سوى قيمة متوسطة ، ولكل بروتين عامل تحويل مختلف اعتمادًا على تركيبته من الأحماض الأمينية. يمكن تقسيم طريقة Kjeldahl بسهولة إلى ثلاث خطوات: الهضم والتحييد والمعايرة.

يتم وزن عينة الطعام المراد تحليلها في دورق هضم ثم هضمها عن طريق تسخينها في وجود حامض الكبريتيك (عامل مؤكسد يهضم الطعام) وكبريتات الصوديوم اللامائية (لتسريع التفاعل عن طريق رفع درجة الغليان) و محفز ، مثل النحاس ، والسيلينيوم ، والتيتانيوم ، أو الزئبق (لتسريع التفاعل). يحول الهضم أي نيتروجين في الطعام (بخلاف ما هو في شكل نترات أو نيتريت) إلى أمونيا ، والمواد العضوية الأخرى إلى C02 و H2 0. ولا يتم تحرير غاز الأمونيا في محلول حمضي لأن الأمونيا في شكل أيون الأمونيوم (NH 4 +) الذي يرتبط بأيون الكبريتات (SO4 2-) وبالتالي يبقى في المحلول:

بعد الانتهاء من الهضم ، يتم توصيل دورق الهضم بقارورة استقبال بواسطة أنبوب. يتم بعد ذلك تحويل المحلول الموجود في دورق الهضم إلى قلوي بإضافة هيدروكسيد الصوديوم ، والذي يحول كبريتات الأمونيوم إلى غاز أمونيا:

& # 9 (NH 4) 2 SO 4 + 2 NaOH & reg 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 & # 9 (2)

يتم تحرير غاز الأمونيا المتكون من المحلول وينتقل من دورق الهضم إلى دورق الاستقبال - الذي يحتوي على فائض من حمض البوريك. يحول الرقم الهيدروجيني المنخفض للمحلول في دورق الاستقبال غاز الأمونيا إلى أيون الأمونيوم ، وفي نفس الوقت يحول حمض البوريك إلى أيون البورات:

& # 9NH 3 + H 3 BO 3 (حمض البوريك) & Reg NH 4 + + H 2 BO 3 - (بورات أيون) (3)

ثم يتم تقدير محتوى النيتروجين عن طريق معايرة بورات الأمونيوم المتكونة من حمض الكبريتيك القياسي أو حمض الهيدروكلوريك ، باستخدام مؤشر مناسب لتحديد نقطة نهاية التفاعل.

& # 9H 2 BO 3 - + H + & reg H 3 BO 3 (4)

إن تركيز أيونات الهيدروجين (في المولات) المطلوب للوصول إلى نقطة النهاية يعادل تركيز النيتروجين الموجود في الطعام الأصلي (المعادلة 3). يمكن استخدام المعادلة التالية لتحديد تركيز النيتروجين لعينة تزن م جرام باستخدام محلول حمض حمض الهيدروكلوريك x M للمعايرة:

حيث تمثل vs و vb أحجام المعايرة للعينة والفارغة ، و 14 جم هي الوزن الجزيئي للنيتروجين N. عادةً ما يتم تشغيل عينة فارغة في نفس الوقت الذي يتم فيه تحليل المادة لمراعاة أي نيتروجين متبقي قد يكون في الكواشف المستخدمة لإجراء التحليل. بمجرد تحديد محتوى النيتروجين ، يتم تحويله إلى محتوى بروتين باستخدام عامل التحويل المناسب:٪ بروتين = F٪ ن.

6.2.1.4. المميزات والعيوب

& # 9 المزايا. تستخدم طريقة Kjeldahl على نطاق واسع دوليًا ولا تزال الطريقة القياسية للمقارنة مع جميع الطرق الأخرى. إن عالميتها ودقتها العالية وقابليتها للتكاثر الجيد جعلتها الطريقة الرئيسية لتقدير البروتين في الأطعمة.

& # 9 العيوب. لا يعطي مقياسًا للبروتين الحقيقي ، لأن كل النيتروجين في الأطعمة ليس في شكل بروتين. تحتاج البروتينات المختلفة إلى عوامل تصحيح مختلفة لأن لها تسلسلات مختلفة من الأحماض الأمينية. يشكل استخدام حامض الكبريتيك المركز في درجات حرارة عالية خطرًا كبيرًا ، كما هو الحال مع استخدام بعض المحفزات المحتملة. تستغرق التقنية وقتًا طويلاً لتنفيذها.

6.2.2. طريقة دوماس المحسنة

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية آلية قادرة على قياس تركيز البروتين في عينات الطعام بسرعة. تعتمد هذه التقنية على طريقة وصفها لأول مرة عالم يُدعى دوما منذ أكثر من قرن ونصف. لقد بدأ في منافسة طريقة كيلدال كطريقة معيارية لتحليل البروتينات لبعض المواد الغذائية بسبب سرعتها.

يتم حرق عينة من الكتلة المعروفة في حجرة ذات درجة حرارة عالية (حوالي 900 درجة مئوية) في وجود الأكسجين. هذا يؤدي إلى إطلاق CO 2 و H 2 O و N 2. تتم إزالة ثاني أكسيد الكربون وثاني أكسيد الكربون عن طريق تمرير الغازات فوق أعمدة خاصة تمتصها. ثم يتم قياس محتوى النيتروجين عن طريق تمرير الغازات المتبقية عبر عمود به كاشف للتوصيل الحراري في نهايته. يساعد العمود على فصل النيتروجين عن أي متبقي من ثاني أكسيد الكربون و H 2 O قد يكون قد بقي في تيار الغاز. تتم معايرة الأداة عن طريق تحليل مادة نقية ولها تركيز نيتروجين معروف ، مثل EDTA (= 9.59٪ N). وبالتالي يمكن تحويل الإشارة من كاشف الموصلية الحرارية إلى محتوى نيتروجين.كما هو الحال مع طريقة Kjeldahl ، من الضروري تحويل تركيز النيتروجين في العينة إلى محتوى البروتين ، باستخدام عوامل التحويل المناسبة التي تعتمد على التسلسل الدقيق للأحماض الأمينية للبروتين.

6.2.2.2. المميزات والعيوب

& # 9 المزايا: إنها أسرع بكثير من طريقة Kjeldahl (أقل من 4 دقائق لكل قياس ، مقارنة بساعتين إلى Kjeldahl). لا يحتاج إلى مواد كيميائية أو محفزات سامة. يمكن قياس العديد من العينات تلقائيًا. سهلة الاستخدام.

& # 9 العيوب: تكلفة أولية عالية. لا يعطي مقياسًا للبروتين الحقيقي ، لأن كل النيتروجين في الأطعمة ليس في شكل بروتين. تحتاج البروتينات المختلفة إلى عوامل تصحيح مختلفة لأن لها تسلسلات مختلفة من الأحماض الأمينية. حجم العينة الصغير يجعل من الصعب الحصول على عينة تمثيلية.

6.2.3. طرق استخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية

تم ابتكار عدد من الطرق لقياس تركيز البروتين ، والتي تعتمد على التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. تستخدم هذه الطرق إما القدرة الطبيعية للبروتينات على امتصاص (أو تشتيت) الضوء في المنطقة المرئية من الأشعة فوق البنفسجية من الطيف الكهرومغناطيسي ، أو تقوم بتعديل البروتينات كيميائيًا أو فيزيائيًا لجعلها تمتص (أو تشتت) الضوء في هذه المنطقة. المبدأ الأساسي وراء كل من هذه الاختبارات متشابه. بادئ ذي بدء ، يتم تحضير منحنى معايرة الامتصاص (أو التعكر) مقابل تركيز البروتين باستخدام سلسلة من محاليل البروتين ذات التركيز المعروف. يتم قياس امتصاص (أو تعكر) المحلول الذي يتم تحليله بعد ذلك بنفس الطول الموجي ، ويتم تحديد تركيز البروتين من منحنى المعايرة. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين الاختبارات في المجموعات الكيميائية المسؤولة عن امتصاص أو تشتت الإشعاع ، على سبيل المثال ، روابط الببتيد ، والمجموعات الجانبية العطرية ، والمجموعات الأساسية ، والبروتينات المجمعة.

& # 9 يتم تسليط الضوء أدناه على عدد من الطرق المرئية للأشعة فوق البنفسجية الأكثر استخدامًا لتحديد محتوى البروتين في الأطعمة:

قياس مباشر عند 280 نانومتر

يمتص التربتوفان والتيروزين الأشعة فوق البنفسجية بقوة عند 280 نانومتر. يظل محتوى التربتوفان والتيروزين في العديد من البروتينات ثابتًا إلى حد ما ، وبالتالي يمكن استخدام امتصاص محاليل البروتين عند 280 نانومتر لتحديد تركيزها. تتمثل مزايا هذه الطريقة في أن الإجراء سهل التنفيذ ، وغير مدمر ، ولا يلزم وجود كواشف خاصة. العيب الرئيسي هو أن الأحماض النووية تمتص بقوة أيضًا عند 280 نانومتر وبالتالي يمكن أن تتداخل مع قياس البروتين إذا كانت موجودة بتركيزات كافية. ومع ذلك ، فقد تم تطوير طرق للتغلب على هذه المشكلة ، على سبيل المثال ، عن طريق قياس الامتصاصية عند طولين موجيين مختلفين.

ينتج اللون البنفسجي الأرجواني عندما تتفاعل أيونات نحاسية (Cu 2+) مع روابط الببتيد في ظروف قلوية. يمكن شراء كاشف البيوريت ، الذي يحتوي على جميع المواد الكيميائية اللازمة لإجراء التحليل ، تجاريًا. يتم خلطه بمحلول بروتين ثم يُترك لمدة 15-30 دقيقة قبل قراءة الامتصاص عند 540 نانومتر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عدم وجود تداخل من المواد التي تمتص بأطوال موجية منخفضة ، والتقنية أقل حساسية لنوع البروتين لأنها تستخدم الامتصاص الذي يتضمن روابط الببتيد المشتركة لجميع البروتينات ، بدلاً من مجموعات جانبية محددة. ومع ذلك ، فهي ذات حساسية منخفضة نسبيًا مقارنة بالطرق الأخرى المرئية للأشعة فوق البنفسجية.

تجمع طريقة Lowry بين كاشف biuret وكاشف آخر (كاشف Folin-Ciocalteau phenol) الذي يتفاعل مع بقايا التيروزين والتربتوفان في البروتينات. هذا يعطي لونًا مزرقًا يمكن قراءته في مكان ما بين 500-750 نانومتر حسب الحساسية المطلوبة. هناك ذروة صغيرة حوالي 500 نانومتر يمكن استخدامها لتحديد تركيزات البروتين العالية وذروة كبيرة حوالي 750 نانومتر يمكن استخدامها لتحديد تركيزات البروتين المنخفضة. هذه الطريقة أكثر حساسية للتراكيز المنخفضة من البروتينات من طريقة البيوريت.

تتم إضافة فائض معروف من صبغة سالبة الشحنة (أنيوني) إلى محلول بروتين يتم تعديل الأس الهيدروجيني له بحيث يتم شحن البروتينات إيجابًا (أي & lt النقطة المتساوية الكهربية). تشكل البروتينات معقدًا غير قابل للذوبان مع الصبغة بسبب التجاذب الكهروستاتيكي بين الجزيئات ، لكن الصبغة غير المقيدة تظل قابلة للذوبان. ترتبط الصبغة الأنيونية بالمجموعات الموجبة لبقايا الأحماض الأمينية الأساسية (الهيستيدين والأرجانين والليسين) والمجموعات الطرفية الأمينية الحرة. يتم تحديد كمية الصبغة غير المقيدة المتبقية في المحلول بعد إزالة مركب صبغة البروتين غير القابل للذوبان (على سبيل المثال ، بالطرد المركزي) عن طريق قياس امتصاصه. تتناسب كمية البروتين الموجودة في المحلول الأصلي مع كمية الصبغة المرتبطة به: صبغة مرتبطة = صبغة أولية - خالية من الصبغة.

يمكن جعل جزيئات البروتين التي عادة ما تكون قابلة للذوبان في المحلول تترسب عن طريق إضافة مواد كيميائية معينة ، على سبيل المثال ، حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. يتسبب ترسيب البروتين في تعكر المحلول. وبالتالي يمكن تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس درجة التعكر.

6.2.3.2. المميزات والعيوب

& # 9 المزايا: التقنيات المرئية للأشعة فوق البنفسجية سريعة وسهلة التنفيذ ، وحساسة لتركيزات البروتينات المنخفضة.

العيوب: بالنسبة لمعظم التقنيات المرئية للأشعة فوق البنفسجية ، من الضروري استخدام محاليل مخففة وشفافة ، والتي لا تحتوي على مواد ملوثة تمتص أو تشتت الضوء بنفس الطول الموجي للبروتين الذي يتم تحليله. تعني الحاجة إلى حلول شفافة أن معظم الأطعمة يجب أن تخضع لكميات كبيرة من تحضير العينات قبل أن يتم تحليلها ، على سبيل المثال ، التجانس ، واستخراج المذيبات ، والطرد المركزي ، والترشيح ، والتي يمكن أن تستغرق وقتًا طويلاً وشاقة. بالإضافة إلى ذلك ، يصعب أحيانًا استخراج البروتينات كميًا من أنواع معينة من الأطعمة ، خاصة بعد معالجتها بحيث تصبح البروتينات مجمعة أو مرتبطة تساهميًا بمواد أخرى. بالإضافة إلى أن الامتصاص يعتمد على نوع البروتين الذي تم تحليله (البروتينات المختلفة لها تسلسلات مختلفة من الأحماض الأمينية).

6.2.4. تقنيات الآلات الأخرى

هناك مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة المتاحة لتحديد محتوى البروتين الكلي للمواد الغذائية. يمكن تقسيم هذه إلى ثلاث فئات مختلفة وفقًا لمبادئها الفيزيائية والكيميائية: (1) قياس الخصائص الفيزيائية السائبة ، (2) قياس امتصاص الإشعاع ، و (3) قياس تشتت الإشعاع. كل طريقة آلية لها مزاياها وعيوبها ، ومجموعة الأطعمة التي يمكن تطبيقها عليها.

قياس الخصائص الفيزيائية السائبة

  • الكثافة: كثافة البروتين أكبر من كثافة معظم مكونات الطعام الأخرى ، وبالتالي هناك زيادة في كثافة الطعام مع زيادة محتواه من البروتين. وبالتالي يمكن تحديد محتوى البروتين في الأطعمة عن طريق قياس كثافتها.
  • معامل الانكسار: يزداد معامل الانكسار لمحلول مائي مع زيادة تركيز البروتين ، وبالتالي يمكن استخدام قياسات RI لتحديد محتوى البروتين.

قياس امتزاز الإشعاع

  • الأشعة فوق البنفسجية المرئية: يمكن تحديد تركيز البروتينات عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المرئية (انظر أعلاه).
  • الأشعة تحت الحمراء: يمكن استخدام تقنيات الأشعة تحت الحمراء لتحديد تركيز البروتينات في عينات الطعام. تمتص البروتينات الأشعة تحت الحمراء بشكل طبيعي بسبب الاهتزازات المميزة (التمدد والانحناء) لمجموعات كيميائية معينة على طول العمود الفقري متعدد الببتيد. وبالتالي يمكن استخدام قياسات امتصاص الإشعاع عند أطوال موجية معينة لتحديد تركيز البروتين في العينة. IR مفيد بشكل خاص للتحليل السريع عبر الإنترنت لمحتوى البروتين. كما أنه يتطلب القليل من تحضير العينة وغير مدمر. عيوبه الرئيسية هي ارتفاع تكلفته الأولية والحاجة إلى معايرة واسعة النطاق.
  • الرنين المغناطيسي النووي: يمكن استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتحديد تركيز البروتين الكلي في الأطعمة. يتم تحديد محتوى البروتين عن طريق قياس المنطقة الواقعة تحت الذروة في أطياف التحول الكيميائي بالرنين المغناطيسي النووي الذي يتوافق مع جزء البروتين.

قياس تشتت الإشعاع

  • تشتت الضوء: يمكن تحديد تركيز مجاميع البروتين في محلول مائي باستخدام تقنيات تشتت الضوء لأن تعكر المحلول يتناسب طرديًا مع تركيز الركام الموجود.
  • نثر الموجات فوق الصوتية: يمكن أيضًا تحديد تركيز مجاميع البروتين باستخدام تقنيات التشتت بالموجات فوق الصوتية لأن سرعة الموجات فوق الصوتية وامتصاصها مرتبطان بتركيز مجاميع البروتين الموجودة.

6.2.4.2. المميزات والعيوب

عدد من هذه الأساليب الآلية لها مزايا كبيرة مقارنة بالتقنيات الأخرى المذكورة أعلاه لأنها غير مدمرة ، وتتطلب القليل من التحضير للعينة أو لا تتطلب أي تحضير على الإطلاق ، كما أن القياسات سريعة ودقيقة. من العيوب الرئيسية للتقنيات التي تعتمد على قياسات الخصائص الفيزيائية للأطعمة أنه يجب تحضير منحنى معايرة بين الخاصية الفيزيائية ذات الأهمية ومحتوى البروتين الكلي ، وهذا قد يعتمد على نوع البروتين الموجود والغذاء المصفوفة الواردة بداخلها. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استخدام التقنيات القائمة على قياسات الخصائص الفيزيائية والكيميائية إلا لتحليل الأطعمة ذات التركيبات البسيطة نسبيًا. في الغذاء الذي يحتوي على العديد من المكونات المختلفة التي قد يختلف تركيزها ، من الصعب فصل مساهمة البروتين في القياس الكلي عن المكونات الأخرى.

6.2.5. مقارنة الأساليب

بصفتنا علماء أغذية ، قد نكون غالبًا في وضع يتعين علينا فيه اختيار تقنية معينة لقياس تركيز البروتين في الطعام. كيف نقرر أي تقنية هي الأنسب لتطبيقنا الخاص؟ أول شيء يجب تحديده هو الغرض من استخدام المعلومات. إذا تم إجراء التحليل لأغراض رسمية ، على سبيل المثال ، المتطلبات القانونية أو المتعلقة بوضع العلامات ، فمن المهم استخدام طريقة معترف بها رسميًا. تمت الموافقة رسميًا على طريقة Kjeldahl ، وبشكل متزايد طريقة Dumas ، لمجموعة واسعة من التطبيقات الغذائية. في المقابل ، تم التعرف رسميًا على عدد قليل فقط من تطبيقات التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية.

& # 9 لأغراض مراقبة الجودة ، غالبًا ما يكون من المفيد الحصول على قياسات سريعة وبسيطة لمحتوى البروتين ، وبالتالي فإن تقنيات الأشعة تحت الحمراء هي الأنسب. بالنسبة للدراسات الأساسية في المختبر ، حيث غالبًا ما يتم تحليل البروتينات النقية ، غالبًا ما يُفضل استخدام تقنيات التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية لأنها تعطي قياسات سريعة وموثوقة ، وحساسة لتركيزات البروتين المنخفضة.

& # 9 العوامل الأخرى التي يجب أخذها في الاعتبار هي مقدار تحضير العينة المطلوب وحساسيتها وسرعتها. تتطلب طرق Kjeldahl و Dumas و IR القليل جدًا من تحضير العينات. بعد اختيار عينة تمثيلية من الطعام ، يمكن عادةً اختبارها مباشرةً. من ناحية أخرى ، تتطلب الطرق المختلفة المرئية للأشعة فوق البنفسجية تحضير عينة مكثف قبل التحليل. يجب استخلاص البروتين من الطعام إلى محلول شفاف مخفف ، والذي عادة ما يتضمن عملية التجانس التي تستغرق وقتًا طويلاً ، واستخراج المذيبات ، وإجراءات الترشيح والطرد المركزي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب عزل بعض البروتينات تمامًا عن الأطعمة لأنها مرتبطة بشدة بمكونات أخرى. التقنيات المختلفة لها أيضًا حساسيات مختلفة ، أي أقل تركيز للبروتين يمكن اكتشافه. تعتبر الطرق المرئية للأشعة فوق البنفسجية هي الأكثر حساسية ، فهي قادرة على اكتشاف تركيزات البروتين منخفضة مثل 0.001٪ بالوزن. تبلغ حساسية طرق Dumas و Kjeldahl و IR حوالي 0.1٪ بالوزن. يعد الوقت المطلوب لكل تحليل وعدد العينات التي يمكن تشغيلها في وقت واحد من العوامل المهمة التي يجب مراعاتها عند تحديد التقنية التحليلية التي يجب استخدامها. تقنيات الأشعة تحت الحمراء قادرة على التحليل السريع (دقيقة واحدة) لتركيز البروتين بمجرد معايرتها. طريقة Dumas الآلية الحديثة مؤتمتة بالكامل ويمكنها قياس تركيز البروتين لعينة في أقل من 5 دقائق ، مقارنة بطريقة Kjeldahl التي تستغرق ما بين 30 دقيقة وساعتين لتنفيذها. تتراوح الطرق المختلفة المرئية للأشعة فوق البنفسجية من دقيقتين إلى ساعة (اعتمادًا على نوع الصبغة المستخدمة والمدة التي يستغرقها التفاعل) ، على الرغم من أنها تتمتع بميزة إمكانية تشغيل العديد من العينات في وقت واحد. ومع ذلك ، فمن الضروري عادة إجراء تحضير مكثف للعينة قبل التحليل من أجل الحصول على حل شفاف. العوامل الأخرى التي قد تكون مهمة عند اختيار تقنية مناسبة هي: المعدات المتاحة ، سهولة التشغيل ، الدقة المطلوبة ، وما إذا كانت التقنية غير مدمرة أم لا.

6.3 فصل البروتين وتوصيفه

في المحاضرة السابقة ، تمت مناقشة التقنيات المستخدمة لتحديد التركيز الكلي للبروتين في الغذاء. غالبًا ما يهتم محللو الأغذية أيضًا بنوع البروتينات الموجودة في الطعام لأن كل بروتين له خصائص غذائية وكيميائية فيزيائية فريدة. عادةً ما يتم تحديد نوع البروتين عن طريق فصل البروتينات الفردية وعزلها عن خليط معقد من البروتينات ، بحيث يمكن التعرف عليها وتوصيفها لاحقًا. يتم فصل البروتينات على أساس الاختلافات في خواصها الفيزيائية والكيميائية ، مثل الحجم والشحنة وخصائص الامتزاز والذوبان والاستقرار الحراري. يعتمد اختيار تقنية الفصل المناسبة على عدد من العوامل ، بما في ذلك أسباب إجراء التحليل ، وكمية العينة المتاحة ، والنقاء المطلوب ، والمعدات المتاحة ، ونوع البروتينات الموجودة والتكلفة. تتوفر طرق واسعة النطاق للعزل الخام لكميات كبيرة من البروتينات ، في حين أن الطرق الصغيرة متاحة للبروتينات باهظة الثمن أو المتوفرة بكميات صغيرة فقط. أحد العوامل التي يجب مراعاتها أثناء إجراء الفصل هو إمكانية تغيير الهيكل الأصلي ثلاثي الأبعاد لجزيئات البروتين.

تعتبر المعرفة المسبقة بتأثيرات الظروف البيئية على بنية البروتين والتفاعلات مفيدة للغاية عند اختيار تقنية الفصل الأنسب. أولاً ، لأنه يساعد في تحديد أنسب الظروف لاستخدامها لعزل بروتين معين من مزيج من البروتينات (على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية والمذيب ودرجة الحرارة وما إلى ذلك) ، وثانيًا ، لأنه قد يكون من المهم اختيار الظروف التي سوف لا تؤثر سلبًا على التركيب الجزيئي للبروتينات.

6.3.1. طرق تعتمد على خصائص الذوبان المختلفة

يمكن فصل البروتينات عن طريق استغلال الاختلافات في قابليتها للذوبان في المحاليل المائية. يتم تحديد قابلية ذوبان جزيء البروتين من خلال تسلسل الحمض الأميني الخاص به لأن هذا يحدد حجمه وشكله ونفاذه للماء وشحنته الكهربائية. يمكن أن تترسب البروتينات أو تذوب بشكل انتقائي عن طريق تغيير درجة الحموضة أو القوة الأيونية أو ثابت العزل الكهربائي أو درجة حرارة المحلول. تعد تقنيات الفصل هذه أبسط طرق الاستخدام عند استخدام كميات كبيرة من العينة ، لأنها سريعة نسبيًا وغير مكلفة ولا تتأثر بشكل خاص بالمكونات الغذائية الأخرى. غالبًا ما يتم استخدامها كخطوة أولى في أي إجراء فصل لأنه يمكن إزالة غالبية المواد الملوثة بسهولة.

تترسب البروتينات من المحاليل المائية عندما يتجاوز تركيز الملح المستوى الحرج ، والذي يُعرف بالتمليح ، لأن كل الماء "مرتبط" بالأملاح ، وبالتالي لا يتوفر لترطيب البروتينات. تُستخدم كبريتات الأمونيوم [(NH 4) 2 SO 4] بشكل شائع لأنها تحتوي على قابلية عالية للذوبان في الماء ، على الرغم من أنه يمكن أيضًا استخدام أملاح متعادلة أخرى ، على سبيل المثال ، NaCl أو KCl. بشكل عام ، يتم استخدام إجراء من خطوتين لتعظيم كفاءة الفصل. في الخطوة الأولى ، يضاف الملح بتركيز أقل بقليل من الضروري لترسيب البروتين المطلوب. ثم يُطرد المحلول مركزيًا لإزالة أي بروتينات أقل قابلية للذوبان من البروتين محل الاهتمام. ثم يتم زيادة تركيز الملح إلى نقطة أعلى بقليل من المطلوب لإحداث ترسيب للبروتين. يؤدي هذا إلى ترسيب البروتين المطلوب (والذي يمكن فصله عن طريق الطرد المركزي) ، ولكنه يترك المزيد من البروتينات القابلة للذوبان في المحلول. المشكلة الرئيسية في هذه الطريقة هي أن التركيزات الكبيرة من الملح تلوث المحلول ، والذي يجب إزالته قبل أن يتم حل البروتين ، على سبيل المثال ، عن طريق غسيل الكلى أو الترشيح الفائق.

النقطة المتساوية الكهربية (pI) للبروتين هي الرقم الهيدروجيني حيث تكون الشحنة الصافية على البروتين صفراً. تميل البروتينات إلى التجمع والترسيب عند pI لأنه لا يوجد تنافر إلكتروستاتيكي يفصل بينها. تحتوي البروتينات على نقاط متساوية كهربية مختلفة بسبب تسلسلها الأحماض الأمينية المختلفة (أي الأعداد النسبية للمجموعات الأنيونية والكاتيونية) ، وبالتالي يمكن فصلها عن طريق ضبط درجة الحموضة في المحلول. عندما يتم تعديل الأس الهيدروجيني إلى pI لبروتين معين فإنه يترسب وترك البروتينات الأخرى في المحلول.

تعتمد قابلية ذوبان البروتين على ثابت العزل الكهربائي للمحلول المحيط به لأن هذا يغير حجم التفاعلات الكهروستاتيكية بين المجموعات المشحونة. نظرًا لأن ثابت العزل الكهربائي لمحلول ما يقلل من حجم التفاعلات الكهروستاتيكية بين الأنواع المشحونة. هذا يميل إلى تقليل قابلية ذوبان البروتينات في المحلول لأنها أقل تأينًا ، وبالتالي فإن التنافر الكهروستاتيكي بينهما لا يكفي لمنعها من التكدس. يمكن خفض ثابت العزل الكهربائي للمحاليل المائية عن طريق إضافة مذيبات عضوية قابلة للذوبان في الماء ، مثل الإيثانول أو الأسيتون. تعتمد كمية المذيب العضوي المطلوبة للتسبب في الترسيب على البروتين وبالتالي يمكن فصل البروتينات على هذا الأساس. تتراوح الكمية المثلى من المذيب العضوي المطلوب لترسيب البروتين من حوالي 5 إلى 60٪. عادة ما يتم إجراء تجزئة المذيبات عند 0 درجة مئوية أو أقل لمنع تمسخ البروتين الناتج عن الزيادات في درجات الحرارة التي تحدث عند خلط المذيبات العضوية مع الماء.

تمسخ البروتينات الملوثة

يتم تغيير طبيعة العديد من البروتينات وترسبها من المحلول عند تسخينها فوق درجة حرارة معينة أو عن طريق ضبط محلول على درجة عالية من الحموضة أو الأس الهيدروجيني القاعدية. يمكن بسهولة فصل البروتينات التي تكون مستقرة عند درجة حرارة عالية أو في أقصى درجات الحموضة بواسطة هذه التقنية لأن البروتينات الملوثة يمكن أن تترسب بينما يظل البروتين محل الاهتمام في المحلول.

6.3.2. الفصل بسبب خصائص الامتزاز المختلفة

يتضمن كروماتوغرافيا الامتزاز فصل المركبات عن طريق الامتزاز الانتقائي الامتزاز في مصفوفة صلبة موجودة داخل عمود يمر من خلاله الخليط. يعتمد الفصل على الصلات المختلفة للبروتينات المختلفة للمصفوفة الصلبة. كروماتوغرافيا التقارب والتبادل الأيوني هما النوعان الرئيسيان من كروماتوغرافيا الامتزاز المستخدمة عادة لفصل البروتينات. يمكن إجراء الفصل باستخدام إما عمود مفتوح أو كروماتوجرافيا سائل عالي الضغط.

كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

يعتمد كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على الامتزاز القابل للانعكاس وامتصاص الأيونات في المحلول إلى مصفوفة صلبة مشحونة أو شبكة بوليمر. هذه التقنية هي أكثر تقنية كروماتوغرافية استخدامًا لفصل البروتين. تسمى المصفوفة موجبة الشحنة مبادل الأنيون لأنها تربط الأيونات سالبة الشحنة (الأنيونات). تسمى المصفوفة سالبة الشحنة مبادل أيوني للقطط لأنها تربط أيونات موجبة الشحنة (كاتيونات). يتم ضبط ظروف المخزن المؤقت (الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية) لصالح أقصى ارتباط للبروتين ذي الأهمية بعمود التبادل الأيوني. ترتبط البروتينات الملوثة بقوة أقل وبالتالي تمر بسرعة أكبر عبر العمود. يتم بعد ذلك التصفية من البروتين محل الاهتمام باستخدام محلول منظم آخر يفضل امتصاصه من العمود (على سبيل المثال ، درجة حموضة مختلفة أو قوة أيونية).

يستخدم كروماتوغرافيا الانجذاب طورًا ثابتًا يتكون من يجند مرتبط تساهميًا بدعامة صلبة. الليجند هو جزيء له تقارب عكسي خاص وفريد ​​من نوعه لبروتين معين. يتم تمرير العينة المراد تحليلها عبر العمود ويرتبط البروتين المعني بالرابط ، بينما تمر البروتينات الملوثة من خلاله مباشرة. يتم بعد ذلك التصفية من البروتين محل الاهتمام باستخدام محلول منظم يفضل امتصاصه من العمود. هذه التقنية هي الوسيلة الأكثر فعالية لفصل البروتين الفردي عن مزيج البروتينات ، لكنها الأغلى تكلفة ، بسبب الحاجة إلى وجود أعمدة ذات روابط محددة مرتبطة بها.

يستخدم كل من التبادل الأيوني وكروماتوجرافيا التقارب بشكل شائع لفصل البروتينات والأحماض الأمينية في المختبر. يتم استخدامها بشكل أقل شيوعًا لعمليات الفصل التجارية لأنها غير مناسبة للفصل السريع للكميات الكبيرة وهي باهظة الثمن نسبيًا.

6.3.3. الفصل بسبب اختلافات الحجم

يمكن أيضًا فصل البروتينات حسب حجمها. عادة ، تختلف الأوزان الجزيئية للبروتينات من حوالي 10000 إلى 1000000 دالتون. من الناحية العملية ، يعتمد الفصل على نصف قطر ستوكس للبروتين ، وليس على وزنه الجزيئي بشكل مباشر. نصف قطر ستوكس هو متوسط ​​نصف قطر البروتين في المحلول ، ويعتمد على هيكله الجزيئي ثلاثي الأبعاد. بالنسبة للبروتينات التي لها نفس الوزن الجزيئي ، يزداد نصف قطر Stokes بالترتيب التالي: بروتين كروي مضغوط & lt مرن ملف عشوائي & lt بروتين شبيه بالقضيب.

يُستخدم غسيل الكلى لفصل الجزيئات في المحلول باستخدام أغشية شبه منفذة تسمح بمرور جزيئات أصغر من حجم معين من خلالها ، ولكنها تمنع مرور الجزيئات الأكبر حجمًا. يتم وضع محلول بروتيني في أنبوب غسيل الكلى والذي يتم غلقه ووضعه في كمية كبيرة من الماء أو المخزن المؤقت الذي يتم تحريكه ببطء. تتدفق المواد المذابة ذات الوزن الجزيئي المنخفض عبر الكيس ، لكن جزيئات البروتين ذات الوزن الجزيئي الكبير تبقى في الكيس. غسيل الكلى هو طريقة بطيئة نسبيًا ، ويستغرق إكمالها ما يصل إلى 12 ساعة. لذلك يتم استخدامه بشكل متكرر في المختبر. غالبًا ما يستخدم غسيل الكلى لإزالة الملح من محاليل البروتين بعد فصلها عن طريق التمليح وتغيير المحاليل.

يتم وضع محلول من البروتين في خلية تحتوي على غشاء نصف نافذ ، ويتم تطبيق الضغط. تمر الجزيئات الأصغر عبر الغشاء ، بينما تبقى الجزيئات الأكبر في المحلول. وبالتالي ، فإن مبدأ الفصل في هذه التقنية يشبه غسيل الكلى ، ولكن نظرًا لتطبيق الضغط ، يكون الفصل أسرع بكثير. تتوفر أغشية شبه منفذة بنقاط قطع بين حوالي 500 إلى 300000. يسمى هذا الجزء من المحلول الذي تحتفظ به الخلية (الجزيئات الكبيرة) بالترشيح الفائق ، في حين أن الجزء الذي يمر عبر الغشاء (الجزيئات الصغيرة) يشكل جزءًا من الترشيح الفائق. يمكن استخدام الترشيح الفائق لتركيز محلول البروتين أو إزالة الأملاح أو تبادل المحاليل أو تجزئة البروتينات على أساس حجمها. تُستخدم وحدات الترشيح الفائق في المختبر وعلى نطاق تجاري.

استبعاد حجم اللوني

هذه التقنية ، التي تُعرف أحيانًا باسم الترشيح الهلامي ، تفصل أيضًا البروتينات وفقًا لحجمها. يُسكب محلول بروتيني في عمود معبأ بحبيبات مسامية مصنوعة من مادة بوليمرية متصالبة (مثل ديكستران أو أغروس). يتم استبعاد الجزيئات الأكبر من المسام الموجودة في الحبيبات ، وتتحرك بسرعة عبر العمود ، بينما تتأخر حركة الجزيئات التي تدخل المسام. وهكذا يتم التخلص من الجزيئات من العمود بترتيب تناقص الحجم. تتوفر حبات ذات حجم مسام متوسط ​​مختلف لفصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة. يوفر مصنعو هذه الخرزات معلومات حول نطاق الوزن الجزيئي الأكثر ملاءمة للفصل. يمكن تحديد الأوزان الجزيئية لبروتينات غير معروفة من خلال مقارنة أحجام شطفها Vo ، مع تلك التي تم تحديدها باستخدام بروتينات ذات وزن جزيئي معروف: يجب أن يعطي مخطط حجم الشطف مقابل اللوغاريتم (الوزن الجزيئي) خطًا مستقيمًا. تتمثل إحدى مشكلات هذه الطريقة في أن الوزن الجزيئي لا يرتبط ارتباطًا مباشرًا بنصف قطر ستوكس لبروتينات مختلفة الشكل.

6.3.4. الفصل بواسطة الرحلان الكهربائي

يعتمد الرحلان الكهربائي على الاختلافات في هجرة الجزيئات المشحونة في المحلول عند تطبيق مجال كهربائي عبره. يمكن استخدامه لفصل البروتينات على أساس حجمها أو شكلها أو شحنتها.

في الرحلان الكهربي غير المتحول للطبيعة ، يتم سكب محلول مخزون من البروتينات الأصلية على هلام مسامي (عادة بولي أكريلاميد أو نشا أو اغروس) ويتم تطبيق جهد كهربائي عبر الهلام. تتحرك البروتينات عبر الهلام في اتجاه يعتمد على علامة شحنتها ، وبمعدل يعتمد على حجم الشحنة ، والاحتكاك مع حركتها:

قد تكون البروتينات موجبة أو سالبة الشحنة في المحلول اعتمادًا على نقاطها الكهربية (pI) ودرجة الحموضة في المحلول. يتم شحن البروتين سالبًا إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من pI ، ويكون مشحونًا بشكل إيجابي إذا كان الرقم الهيدروجيني أقل من pI. سيحدد حجم الشحنة والجهد المطبق مدى انتقال البروتينات في وقت معين. كلما زاد الجهد الكهربائي أو زادت شحنة البروتين كلما تحركت. يعتبر احتكاك الجزيء مقياسًا لمقاومته للحركة عبر الهلام ويتم تحديده إلى حد كبير بالعلاقة بين الحجم الفعال للجزيء وحجم المسام في الهلام. كلما كان حجم الجزيء أصغر ، أو زاد حجم المسام في الهلام ، قلت المقاومة ، وبالتالي يتحرك الجزيء بشكل أسرع عبر الهلام. يمكن شراء المواد الهلامية ذات المسامية المختلفة من موردي المواد الكيميائية أو تصنيعها في المختبر. يتم الحصول على أحجام مسام أصغر باستخدام تركيز أعلى من كاشف الارتباط المتقاطع لتشكيل الجل. يمكن احتواء المواد الهلامية بين لوحين متوازيين أو في أنابيب أسطوانية. في الرحلان الكهربي غير المتحول للطبيعة ، يتم فصل البروتينات الأصلية بناءً على مجموعة من شحنتها وحجمها وشكلها.

في تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي ، يتم فصل البروتينات بشكل أساسي على وزنها الجزيئي. يتم تغيير طبيعة البروتينات قبل التحليل عن طريق مزجها مع مركابتوإيثانول ، الذي يفكك روابط ثنائي كبريتيد الصوديوم ، وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، وهو عامل سطحي أنيوني يرتبط بشكل كاره للماء بجزيئات البروتين ويؤدي إلى ظهورها بسبب التنافر بين الفاعل بالسطح ذي الشحنة السالبة. مجموعات الرأس. يرتبط كل جزيء بروتين تقريبًا بنفس الكمية من SDS لكل وحدة طول. ومن ثم ، فإن الشحنة لكل وحدة طول والتشكيل الجزيئي متماثلان تقريبًا لجميع البروتينات. عندما تنتقل البروتينات عبر شبكة هلامية يتم فصلها بشكل أساسي على أساس وزنها الجزيئي لأن حركتها تعتمد على حجم جزيء البروتين بالنسبة لحجم المسام في الهلام: البروتينات الأصغر تتحرك بسرعة أكبر عبر المصفوفة أكثر من أكبر الجزيئات. يُطلق على هذا النوع من الرحلان الكهربي عادةً اسم كبريتات دوديسيل الصوديوم -بولي أكريلاميد جل الكهربائي ، أو SDS-PAGE.

لتحديد مدى تحرك البروتينات ، تتم إضافة صبغة تتبع إلى محلول البروتين ، على سبيل المثال ، أزرق بروموفينول. هذه الصبغة عبارة عن جزيء صغير مشحون يهاجر قبل البروتينات. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، تصبح البروتينات مرئية عن طريق معالجة الجل بصبغة بروتين مثل Coomassie Brilliant Blue أو بقعة الفضة. يتم حساب التنقل النسبي لكل نطاق بروتين:

غالبًا ما يستخدم الرحلان الكهربائي لتحديد تركيبة البروتين في المنتجات الغذائية. يتم استخلاص البروتين من الطعام إلى محلول ، ثم يتم فصله باستخدام الرحلان الكهربي. يتم استخدام SDS-PAGE لتحديد الوزن الجزيئي لبروتين عن طريق قياس R m ، ثم مقارنته بمنحنى معايرة تم إنتاجه باستخدام بروتينات ذات وزن جزيئي معروف: مخطط السجل (الوزن الجزيئي) مقابل التنقل النسبي عادةً ما يكون خطيًا. يعد تغيير طبيعة الرحلان الكهربي أكثر فائدة في تحديد الأوزان الجزيئية من الرحلان الكهربي غير المتحول ، لأن الاحتكاك بالحركة لا يعتمد على الشكل أو الشحنة الأصلية لجزيئات البروتين.

الرحلان الكهربائي المركّز الكهروضوئي

هذه التقنية عبارة عن تعديل للرحلان الكهربائي ، حيث يتم فصل البروتينات بشحنة على مصفوفة هلامية تحتوي على تدرج pH عبرها. تهاجر البروتينات إلى المكان الذي يساوي فيه الرقم الهيدروجيني نقطة تساوي الكهرباء ثم تتوقف عن الحركة لأنها لم تعد مشحونة. تتمتع هذه الطرق بأحد أعلى درجات الدقة بين جميع التقنيات المستخدمة لفصل البروتينات. تتوفر المواد الهلامية التي تغطي نطاقًا ضيقًا من الأس الهيدروجيني (2-3 وحدات) أو نطاقًا واسعًا من الأس الهيدروجيني (3-10 وحدات) ، وبالتالي يجب على المرء اختيار مادة هلامية أكثر ملاءمة للبروتينات التي يتم فصلها.

ثنائي الأبعاد الكهربائي

يمكن استخدام التركيز الكهروضوئي و SDS-PAGE معًا لتحسين دقة خلائط البروتين المعقدة. يتم فصل البروتينات في اتجاه واحد على أساس الشحنة باستخدام التركيز الكهروضوئي ، ثم في اتجاه عمودي على أساس الحجم باستخدام SDS-PAGE.


F4. التفاعلات الكارهة للماء: مقدمة

  • بمساهمة هنري جاكوبوفسكي
  • أستاذ (كيمياء) بكلية القديس بنديكت / ش. جامعة جون

لقد درسنا دور التأثير الكارثي للماء (الذي يتضمن إطلاق الانتروبيا الإيجابي لجزيئات الماء في قفص حول المجموعات الكارهة للماء المعرضة للمذيبات) في قيادة تكوين الميلي والطبقة الثنائية. هل يؤدي هذا أيضًا إلى طي البروتين؟ لاستكشاف هذه الأسئلة ، سوف ندرس الديناميكا الحرارية للجزيئات الصغيرة غير القطبية ، وخاصة البنزين ، مع الماء ونسأل ما إذا كانت المعلمة الديناميكية الحرارية المرتبطة بقابلية ذوبان البنزين مماثلة لتلك المرتبطة باستقرار البروتين. إذا استمر هذا القياس ، فإن أي شيء من شأنه أن يعزز قابلية ذوبان البنزين سيؤدي إلى زيادة تعرض سلسلة الأحماض الأمينية الكارهة للماء للماء وبالتالي تمسخ البروتين. ما هو الدليل على ذلك؟

أ. الهياكل البلورية: تُظهر هذه الهياكل أن معظم السلاسل الجانبية غير القطبية مدفونة داخل بروتين معبأ بإحكام ويستبعد الماء. تشير الدراسات إلى أنه مع زيادة مساحة سطح سلاسل الأحماض الأمينية الجانبية ، تصبح الطاقة الحرة لنقل الأحماض الأمينية من الماء إلى الإيثانول أكثر سلبية.

الشكل: نقل الأحماض الأمينية من الماء

(راجع الطاقات المجانية لنقل المجموعات الكارهة للماء في الفصل 1 د: الدهون في الماء - الديناميكا الحرارية)

ب. تمسخ البروتينات بدرجة حرارة منخفضة - لقد لوحظ أن البروتينات يمكن أن تتغير في درجات حرارة منخفضة (أقل من 0 درجة مئوية) ، مما يشير إلى أن البقايا غير القطبية تصبح أكثر وقابلة للذوبان في الماء عند درجات حرارة منخفضة (أي أنها تنتقل من الجزء الداخلي الأكثر كارهة للماء للبروتين إلى أكثر قطبي خارج). قارن قابلية ذوبان الغازات غير القطبية مثل CO2 أو N2 ، والتي تكون أكثر قابلية للذوبان في درجات الحرارة المنخفضة. عندما تقوم بتسخين محاليل الغازات غير القطبية في الماء ، تصبح الغازات أقل قابلية للذوبان كما يتضح من تكوين الفقاعات (أي فصل الطور للغازات المذابة حيث تصبح أكثر قابلية للذوبان). إذا كان سلوك البروتين محكومًا بنفس السلوك (قابلية ذوبان أكبر للمجموعات غير القطبية في درجات حرارة منخفضة) ، فقد يشير ذلك إلى أن البروتينات قد تتغير في درجات الحرارة المنخفضة (مما يؤدي إلى زيادة التعرض لمياه السلاسل الجانبية غير القطبية). وقد لوحظت هذه الظاهرة.

ج. تأثر استقرار البروتين بأنواع الملح المختلفة - منذ أكثر من 100 عام ، حدد هوفمايستر فعالية الكاتيونات والأنيونات المختلفة من الأملاح لترسيب بروتينات مصل الدم في نطاقات تركيز 0.01 - 1 م. السلسلة موضحة أدناه:

NH4 + & gt K + & gt Na + & gt Li + & gt Mg2 + & gt Ca2 + & gt guanidinium

SO42- & gt HPO42- & gt acetate & gt citrate & gt Cl- & gt NO3- & gt ClO3- & gt I- & gt ClO4- & gt SCN-

  • ملح من أزواج من الأيونات الأولى في هذه السلسلة (على سبيل المثال ، (NH4) 2SO4) ، عند إضافته إلى المحاليل المائية للبروتينات ، يعجل الشكل الأصلي للبروتين. يجب أن نأخذ في الاعتبار حقيقة أنه يترسب البروتين ، وأن البروتين يترسب في الحالة الأصلية ، وليس الحالة المشوهة. المزيد عن سبب ترسبه للبروتينات في لحظة. يزيد الأيون الأول في كل سلسلة من التوتر السطحي للماء (مما يجعل من الصعب عمل تجويف في الماء ليلائم الجزيء غير القطبي). هذا يقلل من قابلية الذوبان في الجزيئات غير القطبية. هذه & quotsalt-out & quot الجزيئات غير القطبية ، لا تعزز الذوبان في الماء ولكن التجميع يليه فصل الطور. عن طريق القياس ، سوف تعمل على استقرار الحالة الأصلية لأن السلاسل الجانبية المدفونة الكارهة للماء سيكون لها ميل منخفض للانتقال إلى البيئة المائية.
  • الأيونات الأخيرة من السلسلة لها تأثير أقل على التوتر السطحي ، وبالتالي تزيد من قابلية الذوبان في الجزيئات غير القطبية (& quotsalt-in & quot). عن طريق القياس ، فإنها ستزعزع استقرار الحالة الأصلية لأن السلاسل الجانبية المدفونة الكارهة للماء سيكون لها ميل متزايد للانتقال إلى البيئة المائية.
  • سلسلة هوفميستر

تزداد قابلية ذوبان البنزين في المحاليل الملحية المائية لهذه السلسلة من اليسار إلى اليمين ، تمامًا كما يتناقص استقرار البروتين الأصلي من اليسار إلى اليمين (أي أن بقايا البروتين غير القطبية تصبح أكثر وقابلة للذوبان في الماء ، مما يؤدي إلى تمسخها).

د. الحفاظ على المخلفات الأساسية كارهة للماء - يتم حفظ هذه البقايا بدرجة عالية وترتبط بالهيكل.

ه. اليوريا تفسد البروتينات - غالبًا ما تستخدم مادة مضافة أخرى ، وهي اليوريا ، بتركيزات عالية لإفساد البروتينات. اعتاد الناس على الاعتقاد بأن اليوريا تتنافس مع روابط H داخل السلسلة وبالتالي تفكك البروتين. تتعارض الحجج المذكورة أعلاه مع روابط H على هذا الخلاف لأن الماء يجب أن يفسد البروتين. كيف تفسد اليوريا البروتينات؟ لقد ثبت أن الطاقة المجانية لنقل الأحماض الأمينية غير القطبية إلى يوريا 8 م تزداد سلبية حيث تصبح السلاسل الجانبية أكبر وأكثر غير قطبية.

الشكل: الطاقة الحرة لنقل الأحماض الأمينية غير القطبية إلى يوريا 8 م

وينطبق هذا أيضًا على تمسخ الطبيعة بواسطة هيدروكلوريد الجوانيدين. تزيد اليوريا أيضًا من قابلية ذوبان الجزيئات غير القطبية بطريقة تتناسب مع مساحة سطحها.


الخصائص الفيزيائية للمنظفات

التركيز الذي تبدأ فيه المذيلات في التكون هو تركيز micelle الحرج (CMC). CMC هو أقصى تركيز للمونومر ويشكل مقياسًا للطاقة الحرة لتكوين الميلي. كلما انخفض الـ CMC ، كلما كانت الميلي أكثر استقرارًا والجزيئات التي يتم دمجها أو إزالتها منها بشكل أبطأ. يمكن أن يؤثر هيكل المنطقة الكارهة للماء للمنظف على بنية الميلي. تؤدي الزيادة في طول سلسلة الهيدروكربون الكارهة للماء للمنظفات الأيونية إلى زيادة حجم الميلي وخفض CMC ، حيث يلزم عدد أقل من الجزيئات لبناء مذيلة.

متوسط ​​عدد المونومرات في micelle هو رقم التجميع. تعتمد قيم CMC ورقم التجميع بشكل كبير على عوامل مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والقوة الأيونية وتجانس المنظفات ونقاوتها. قد تكون الاختلافات الطفيفة في القيم المبلغ عنها لـ CMC ورقم التجميع نتيجة للاختلافات في الأساليب التحليلية المستخدمة لتحديد القيم. يتم أيضًا تغيير قيم رقم التجميع حسب التركيز ، حيث قد يزداد عدد جزيئات المنظف لكل مذيلة إذا كان التركيز أعلى من CMC.

تعتبر سهولة الإزالة أو الاستبدال عاملاً مهمًا في اختيار المنظف. تتضمن بعض طرق إزالة المنظفات الأكثر شيوعًا ما يلي:

  • غسيل الكلى
  • كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي
  • كروماتوغرافيا الامتزاز الكارهة للماء
  • ترسيب البروتين

تعد قيمة CMC المرتبطة بالمنظف دليلًا مفيدًا لقوة الربط الكارهة للماء. المنظفات ذات قيم CMC الأعلى لها ارتباط أضعف وبالتالي يسهل إزالتها عن طريق غسيل الكلى أو طرق الإزاحة. تتطلب المنظفات ذات قيم CMC المنخفضة منظفًا أقل من أجل تكوين المذيلات وتذويب البروتينات أو الدهون.

معلمة أخرى مفيدة عند تقييم المنظفات لإزالة المصب هي الوزن الجزيئي micelle، مما يشير إلى الحجم النسبي للميلي. تتم إزالة المذيلات الصغيرة بسهولة أكبر وعادة ما تكون مرغوبة عند فصل معقدات البروتين والمنظفات على أساس الحجم الجزيئي للبروتين. يمكن حساب الوزن الجزيئي للميلي بضرب رقم التجميع بالوزن الجزيئي المونومر.

ال نقطة السحابة هي درجة الحرارة التي ينفصل عندها محلول المنظف بالقرب من CMC أو أعلى منه إلى مرحلتين. تتراكم المذيلات ، وتشكل عادةً مرحلة غائمة مع تركيز عالٍ من المنظفات ، بينما يصبح توازن المحلول مستنفدًا في المنظفات. يمكن فصل المحلول الناتج على مرحلتين ، مع وضع البروتين المستخلص في المرحلة الغنية بالمنظفات. المنظفات ذات درجات حرارة منخفضة للسحب ، مثل TRITON ® X-114 (نقطة سحابة

23 درجة مئوية) موصى به للاستخدام مع البروتينات لأن درجات الحرارة المرتفعة للسحابة قد تفسد البروتينات المذابة. يمكن أن تتأثر نقطة السحب بالتغيرات في تركيز المنظف ودرجة الحرارة وإضافة الملح أو البوليمرات مثل ديكستران والبولي إيثيلين جلايكول. لاحظ أن المرحلة الغنية بالمنظفات تعتمد أيضًا على المنظف (المنظفات) المحددة وتركيز الملح في ظل بعض الظروف ، قد تكون المرحلة صافية وليست عكرة وتكون إما المرحلة العلوية أو السفلية من المحلول. في المنظفات غير الأيونية ، تم تطبيق هذا السلوك في فصل الطور وتنقية بروتينات الغشاء. 2


التعبير المشترك عن المرافقين و / أو الطيات.

تلعب فئتان من البروتينات دورًا مهمًا في في الجسم الحي البروتين للطي.

  • المرافقون الجزيئية تعزيز الأزمرة المناسبة والاستهداف الخلوي من خلال التفاعل العابر مع الوسائط القابلة للطي. أفضل ما يتسم به بكتريا قولونية الأنظمة هي:
    • جروس جرويل
    • DnaK-DnaJ-GrpE
    • ClpB
    • ببتيدل برولايل رابطة الدول المستقلة / العابرة ايزوميراز (PPI'س)
    • أوكسيريدوكتاز ثنائي كبريتيد (DsbA) وإيزوميراز ثنائي كبريتيد (DsbC)
    • إيزوميراز ثنائي كبريتيد البروتين (PDI) - بروتين حقيقي النواة يحفز كلا من أكسدة بروتين السيستين وأزمرة رابطة ثاني كبريتيد. يعرض أيضًا نشاط المرافقة.

    يمكن أن يؤدي التعبير المشترك لواحد أو أكثر من هذه البروتينات مع البروتين المستهدف إلى مستويات أعلى من البروتين القابل للذوبان. يجب تحسين مستويات التعبير المشترك للمرافقين / الطيات المختلفة لكل حالة على حدة. DsbA و DsbC أظهرت أيضًا تأثيرات إيجابية على مستويات التعبير عند استخدامها كشريك في الاندماج.


    تأثير كارهة للماء ودوره في تمسخ البرد ☆

    يعتبر التأثير الكارثي للماء القوة الدافعة الرئيسية لطي البروتين ويلعب دورًا مهمًا في استقرار تلك الجزيئات الحيوية. يُعزى هذا التأثير أيضًا إلى التمسخ البارد ، حيث تفقد الحالة الأصلية للبروتين ثباتها عند التبريد. لذلك ليس من المستغرب أن يتم بذل الكثير من الجهد لفهم هذه الظاهرة. على الرغم من هذه الجهود ، لا يزال هناك العديد من الجوانب الأساسية التي لم يتم حلها. في هذا البحث نستعرض ونلخص الديناميكا الحرارية للبروتينات وتأثير كارهة للماء وتمسخ البرودة. نبدأ بحساب هذه الظواهر بالعين المجردة ثم ننتقل إلى وصفها على المستوى الذري. نأمل أن تساعد هذه المراجعة القارئ في اكتساب نظرة ثاقبة للدور الذي يلعبه التأثير الكارثي للماء في تمسخ الطبيعة الباردة.


    محتويات

    تتلامس العديد من الأجهزة والمنتجات الطبية مع الأسطح الداخلية للجسم ، مثل الأدوات الجراحية والغرسات. عندما تدخل مادة غير أصلية الجسم ، تحدث الخطوة الأولى للاستجابة المناعية وتستضيف المصفوفة خارج الخلوية وبروتينات البلازما تتجمع في المادة في محاولة لاحتواء العامل الضار أو تحييده أو عزله. [1] يمكن أن تسهل هذه البروتينات ربط أنواع مختلفة من الخلايا مثل بانيات العظم والخلايا الليفية التي يمكن أن تشجع على إصلاح الأنسجة. [2] وبخطوة أبعد ، يمكن تغليف الأجهزة القابلة للزرع بمادة نشطة بيولوجيًا لتشجيع امتصاص بروتينات معينة ، وتشكيل الكبسولات الليفية ، والتئام الجروح. هذا من شأنه أن يقلل من خطر رفض الزرع ويسرع الشفاء عن طريق اختيار البروتينات والخلايا الضرورية اللازمة لتكوين البطانة. بعد تكوين البطانة ، لن يتعرض الجسم بعد الآن للمادة الغريبة ، وسيوقف الاستجابة المناعية.

    غالبًا ما تعمل البروتينات مثل الكولاجين أو الفيبرين كسقالات لالتصاق الخلايا ونموها. هذا جزء لا يتجزأ من السلامة الهيكلية لألواح الخلايا وتمايزها إلى هياكل أكثر تعقيدًا من الأنسجة والأعضاء. تؤثر خصائص التصاق البروتينات على الأسطح غير البيولوجية بشكل كبير على ما إذا كان يمكن للخلايا أن تلتصق بها بشكل غير مباشر عبر السقالات أم لا. تتطلب عملية الزرع مثل استبدال جذع الورك التكامل مع الأنسجة المضيفة ، ويسهل امتصاص البروتين هذا التكامل.

    يمكن تصميم الأدوات الجراحية بحيث يتم تعقيمها بسهولة أكبر بحيث لا تبقى البروتينات ممتصة على الأسطح ، مما يعرضها لخطر التلوث المتبادل. تحدث بعض الأمراض مثل مرض كروتزفيلد جاكوب وكورو (وكلاهما مرتبطان بمرض جنون البقر) بسبب انتقال البريونات ، وهي أشكال خاطئة أو مطوية بشكل غير صحيح من بروتين أصلي طبيعي. تتطلب الأدوات الجراحية الملوثة بالبريونات طريقة خاصة للتعقيم للقضاء تمامًا على جميع العناصر النزرة للبروتين الخاطئ ، لأنها تقاوم العديد من طرق التطهير المعتادة.

    ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن أن يكون امتصاص البروتين للمواد الحيوية حدثًا غير موات للغاية. قد يؤدي التصاق عوامل التخثر إلى تجلط الدم ، مما قد يؤدي إلى السكتة الدماغية أو غيرها من العوائق. [3] تهدف بعض الأجهزة إلى التفاعل مع بيئة الجسم الداخلية مثل المستشعرات أو مركبات توصيل الأدوية ، وقد يعيق امتصاص البروتين فعاليتها.

    البروتينات هي جزيئات حيوية تتكون من وحدات فرعية من الأحماض الأمينية. يحتوي كل حمض أميني على سلسلة جانبية تكتسب أو تفقد شحنتها اعتمادًا على درجة الحموضة في البيئة المحيطة ، بالإضافة إلى صفاته الفردية القطبية / غير القطبية. [4]

    يمكن أن تساهم المناطق المشحونة بشكل كبير في كيفية تفاعل هذا البروتين مع الجزيئات والأسطح الأخرى ، بالإضافة إلى هيكله العالي الخاص (طي البروتين). تميل الأحماض الأمينية المشحونة إلى التواجد على السطح الخارجي للبروتينات نتيجة لكونها محبة للماء ، حيث تكون قادرة على التفاعل مع الأسطح. [5] إنه مزيج فريد من الأحماض الأمينية يعطي البروتين خصائصه. من حيث كيمياء السطح ، يعد امتصاص البروتين ظاهرة حرجة تصف تراكم هذه الجزيئات على السطح الخارجي للمادة. يعتمد ميل البروتينات للبقاء متصلة بالسطح إلى حد كبير على خصائص المواد مثل طاقة السطح ، والملمس ، وتوزيع الشحنة النسبية. من المرجح أن تمتص البروتينات الأكبر حجمًا وتبقى متصلة بالسطح نظرًا لارتفاع عدد مواقع الاتصال بين الأحماض الأمينية والسطح (الشكل 1).

    تحرير طاقة امتصاص البروتين

    الفكرة الأساسية وراء امتصاص البروتين التلقائي هو أن الامتزاز يحدث عندما يتم إطلاق المزيد من الطاقة أكثر من المكتسبة وفقًا لقانون جيبس ​​للطاقة الحرة.

    يظهر هذا في المعادلة:

    • إعلانات هو صافي تغيير المعلمات
    • جي هي طاقة جيبس ​​الحرة
    • تي هي درجة الحرارة (SI unit: kelvin)
    • س هل الانتروبيا (SI unit: joule per kelvin)
    • ح هل المحتوى الحراري (وحدة النظام الدولي: جول)

    من أجل أن يحدث امتصاص البروتين بشكل عفوي ، إعلاناتجي يجب أن يكون رقمًا سالبًا.

    تحرير تأثير فرومان

    تتنافس البروتينات والجزيئات الأخرى باستمرار مع بعضها البعض على مواقع الارتباط على السطح. يفترض تأثير Vroman ، الذي طوره Leo Vroman ، أن الجزيئات الصغيرة والوفرة ستكون أول من يكسو السطح. ومع ذلك ، بمرور الوقت ، سوف تحل محلها الجزيئات ذات التقارب العالي لهذا السطح المعين. غالبًا ما يظهر هذا في المواد التي تلامس الدم حيث يرتبط الفيبرين ، الذي يكون غزيرًا عادةً ، بالسطح أولاً ويتم استبداله ببروتينات أكبر بمرور الوقت. [6]

    معدل تحرير الامتزاز

    من أجل امتصاص البروتينات ، يجب أن تتلامس أولاً مع السطح من خلال واحدة أو أكثر من آليات النقل الرئيسية هذه: الانتشار ، أو الحمل الحراري ، أو التدفق السائب ، أو مزيج منها. عند التفكير في نقل البروتينات ، من الواضح كيف ستؤثر تدرجات التركيز ودرجة الحرارة وحجم البروتين وسرعة التدفق على وصول البروتينات إلى سطح صلب. في ظل ظروف التدفق المنخفض وتدرجات درجة الحرارة الدنيا ، يمكن نمذجة معدل الامتزاز بعد معادلة معدل الانتشار. [5]

    تحرير معادلة معدل الانتشار

    • د هو معامل الانتشار
    • ن هو التركيز السطحي للبروتين
    • شارك هو التركيز الأكبر للبروتينات
    • ر حان الوقت

    يؤدي تركيز الكتلة الأكبر و / أو معامل الانتشار الأعلى (يتناسب عكسياً مع الحجم الجزيئي) إلى وصول عدد أكبر من الجزيئات إلى السطح. تؤدي التفاعلات الناتجة عن سطح البروتين إلى تركيزات محلية عالية من البروتين الممتص ، لتصل إلى تركيزات تصل إلى 1000 مرة أعلى من المحلول السائب. [5] ومع ذلك ، فإن الجسم أكثر تعقيدًا بكثير ، حيث يحتوي على تدفق وانتشار الحمل الحراري ، ويجب مراعاة ذلك في معدل امتصاص البروتين.

    تدفق في قناة رقيقة تحرير

    • ج هو التركيز
    • د هو معامل الانتشار
    • الخامس هي سرعة التدفق
    • x هي المسافة أسفل القناة
    • γ هو معدل قص الجدار
    • ب هو ارتفاع القناة

    تنطبق هذه المعادلة [5] بشكل خاص على تحليل امتصاص البروتين للأجهزة الطبية الحيوية في الشرايين ، على سبيل المثال الدعامات.

    الفئات الأربعة الأساسية للقوى والتفاعل في امتصاص البروتين هي: 1) التفاعل الأيوني أو الكهروستاتيكي ، 2) الترابط الهيدروجيني ، 3) التفاعل الكارثي للماء (مدفوع بشكل كبير عن طريق الانتروبيا) ، و 4) تفاعلات نقل الشحنة أو الجسيمات المانحة / نوع المستقبِل . [7]

    تحرير التفاعلات الأيونية أو الكهروستاتيكية

    يتم تحديد شحنة البروتينات بواسطة pKa في سلاسلها الجانبية للأحماض الأمينية ، والحمض الأميني الطرفي وحمض الكربوكسيل. البروتينات ذات النقطة الكهروضوئية (pI) فوق الظروف الفسيولوجية لها شحنة موجبة والبروتينات التي تحتوي على pI أقل من الظروف الفسيولوجية لها شحنة سالبة. ينتج عن الشحنة الصافية للبروتين ، التي يتم تحديدها من خلال مجموع شحنة مكوناته ، هجرة رحلاني كهربائي في مجال كهربائي فسيولوجي. هذه التأثيرات قصيرة المدى بسبب ارتفاع ثابت التيار الكهربائي للماء ، ومع ذلك ، بمجرد أن يقترب البروتين من سطح مشحون ، يصبح الاقتران الكهروستاتيكي القوة المهيمنة. [8]

    تحرير ارتباط الهيدروجين

    الماء لديه ميل كبير لتكوين روابط هيدروجينية مثل أي مجموعة في بولي ببتيد. أثناء عملية الطي والارتباط ، تتبادل مجموعات الببتيد والأحماض الأمينية روابط الهيدروجين بالماء. وبالتالي ، فإن الرابطة الهيدروجينية ليس لها تأثير استقرار قوي على امتصاص البروتين في وسط مائي. [9]

    رسم توضيحي لاثنين من جزيئات الماء تتفاعل لتكوين رابطة هيدروجينية

    تحرير التفاعلات الكارهة للماء

    التفاعلات الكارهة للماء هي في الأساس تفاعلات إنتروبية ترجع أساسًا إلى ظواهر النظام / الفوضى في وسط مائي. الطاقة الحرة المرتبطة بتقليل المناطق البينية هي المسؤولة عن تقليل مساحة سطح قطرات الماء وفقاعات الهواء في الماء. هذا المبدأ نفسه هو السبب في توجيه السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية الكارهة للماء بعيدًا عن الماء ، مما يقلل من تفاعلها مع الماء. تؤدي المجموعات المحبة للماء الموجودة على الجزء الخارجي من الجزيء إلى قابلية ذوبان البروتين في الماء. يمكن توصيف هذه الظاهرة من خلال معالجة هذه العلاقات الكارهة للماء بمفاهيم الطاقة الحرة البينية. وفقًا لذلك ، يمكن للمرء أن يفكر في القوة الدافعة لهذه التفاعلات على أنها تقليل إجمالي الطاقة البينية الحرة ، أي تقليل مساحة السطح. [10]

    تحرير تفاعلات تحويل الرسوم

    تفاعلات نقل الشحنة مهمة أيضًا في تثبيت البروتين والتفاعل السطحي. في عمليات المتبرع المتلقي العامة ، يمكن للمرء أن يفكر في وجود كثافة الإلكترون الزائدة والتي يمكن التبرع بها لأنواع محبة للكهرباء. في الوسط المائي ، ترجع هذه التفاعلات المذابة بشكل أساسي إلى تأثيرات الإلكترون المداري pi. [11]

    تحرير درجة الحرارة

    درجة الحرارة لها تأثير على كل من حالة التوازن وحركية امتصاص البروتين. عادة ما تكون كمية البروتين التي يتم امتصاصها عند درجة حرارة عالية أعلى من تلك الموجودة في درجة حرارة الغرفة. يؤدي تغير درجة الحرارة إلى تغيرات توافقية في البروتين الذي يؤثر على الامتزاز. ينتج عن إعادة الترتيب المطابقة للبروتينات زيادة في الانتروبيا والتي تعمل كقوة دافعة رئيسية لامتصاص البروتين. يمكن ملاحظة تأثير درجة الحرارة على امتصاص البروتين في عمليات تصنيع الأغذية ، وخاصة الأطعمة السائلة مثل الحليب الذي يسبب تلوثًا شديدًا على أسطح جدران المعدات حيث يتم إجراء المعالجة الحرارية. [12] [13]

    قوة الأيونية تحرير

    تحدد القوة الأيونية طول ديباي المرتبط بمسافة التخميد للجهد الكهربائي لشحنة ثابتة في المنحل بالكهرباء. لذلك ، كلما زادت القوة الأيونية ، كلما كانت التفاعلات الكهروستاتيكية أقصر بين الكيانات المشحونة. نتيجة لذلك ، يتم إعاقة امتصاص البروتينات المشحونة إلى ركائز مشحونة بشكل معاكس في حين يتم تحسين الامتصاص مثل الركائز المشحونة ، وبالتالي التأثير على حركية الامتزاز. كما أن القوة الأيونية العالية تزيد من ميل البروتينات للتجمع. [12]

    نظام متعدد البروتينات تحرير

    عندما يتعرض السطح لمحلول متعدد البروتينات ، يفضل امتصاص جزيئات بروتين معينة على الأخرى. تتنافس جزيئات البروتين التي تقترب من السطح على مواقع الارتباط. في نظام متعدد البروتينات يمكن أن يحدث التجاذب بين الجزيئات ، بينما في المحاليل أحادية البروتين ، تهيمن التفاعلات الباعثة على النفور. بالإضافة إلى ذلك ، هناك انتشار للبروتين يعتمد على الوقت ، حيث تتلامس جزيئات البروتين في البداية مع الحد الأدنى من مواقع الارتباط على السطح. مع زيادة وقت بقاء البروتين على السطح ، قد يتكشف البروتين للتفاعل مع مواقع الارتباط الإضافية. ينتج عن هذا زيادة تعتمد على الوقت في نقاط الاتصال بين البروتين والسطح. هذا يجعل الامتزاز أقل احتمالا. [5]

    تحرير تقنية استنفاد المحلول

    تقيس هذه التقنية تغير تركيز البروتينات في المحلول قبل وبعد الامتزاز ، cص. يُعزى أي تغيير في تركيز البروتين إلى الطبقة الممتصة ، Γص.

    تتطلب هذه الطريقة أيضًا مادة ذات مساحة سطح عالية مثل المواد الماصة الجسيمية والخرز. [14]

    تحرير قياس القطع

    تم استخدام مقياس Ellipsometry على نطاق واسع لقياس حركية امتصاص البروتين بالإضافة إلى بنية طبقة البروتين الممتصة. إنها تقنية بصرية تقيس تغير استقطاب الضوء بعد الانعكاس من سطح ما. تتطلب هذه التقنية أسطحًا مستوية ، عاكسة ، ويفضل أن تكون كوارتز ، أو سيليكون ، أو سيليكا ، وتغيرًا قويًا في معامل الانكسار عند امتصاص البروتين. [12]

    تحرير القوة الذرية المجهري

    يعد الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) تقنية مجهرية قوية تستخدم لدراسة العينات على مقياس نانوي وغالبًا ما تستخدم لتصوير توزيع البروتين على السطح. يتكون من ناتئ مع طرف للمسح فوق السطح. إنها أداة قيمة لقياس التفاعل بين البروتين والبروتين وسطح البروتين. ومع ذلك ، فإن العامل المحدد للعديد من دراسات AFM هو أن التصوير يتم غالبًا بعد تجفيف السطح مما قد يؤثر على طي البروتين وهيكل طبقة البروتين. علاوة على ذلك ، يمكن لطرف الكابول أن يزيح البروتين أو يموج طبقة البروتين. [12] [15]

    تحرير الرنين السطحي للبلازمون

    يستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) على نطاق واسع لقياس امتصاص البروتين بحساسية عالية. تعتمد هذه التقنية على إثارة البلازمونات السطحية ، نشأت الموجات الكهرومغناطيسية الطولية عند السطح البيني بين المعادن والعوازل الكهربائية. يؤدي الترسيب على السطح الموصّل للجزيئات والطبقات الرقيقة في حدود 200 نانومتر إلى تعديل الخصائص العازلة للنظام وبالتالي استجابة SPR ، مما يشير إلى وجود جزيئات على سطح معدني. [16]

    تحرير التوازن الدقيق الكريستال الكوارتز

    ميزان دقيق بلوري كوارتز (QCM) عبارة عن مستشعر صوتي مبني حول بلورة كوارتز على شكل قرص. إنه يستفيد من تأثير كهرضغطية معكوس. تم استخدام QCM ، والإصدارات الموسعة مثل QCM-D ، على نطاق واسع لدراسات امتصاص البروتين ، وخاصة المراقبة في الوقت الحقيقي لامتصاص البروتين الخالي من الملصقات. بالإضافة إلى دراسات الامتصاص ، يوفر QCM-D أيضًا معلومات تتعلق بالمعايير المرنة واللزوجة والتغييرات المطابقة [17]

    تحرير التحليل الطيفي للدليل الموجي البصري

    يعد التحليل الطيفي للدليل الموجي البصري (OWLS) جهازًا يعتمد على دليل موجي بصري ذي غشاء رقيق ، يحوي عددًا منفصلاً من الموجات الكهرومغناطيسية الموجهة. يتم تحقيق التوجيه عن طريق مقرنة صريف. وهو يعتمد على قياسات معامل الانكسار الفعال لطبقة رقيقة فوق الدليل الموجي. تعمل هذه التقنية فقط على الأسطح شديدة الشفافية. [17]

    تشمل الطرق الأخرى المستخدمة على نطاق واسع لقياس كمية البروتين الممتص على الأسطح وضع العلامات الراديوية ، ومقايسة Lowry ، وقياس انعكاس زاوية المسح ، ومضان الانعكاس الداخلي الكلي ، ومقايسة حمض bicinchoninic ، إلخ.

    تحرير التركيب الكيميائي

    يشير الترابط المعدني إلى الترابط المحدد بين أيونات المعادن الموجبة وسحب إلكترون التكافؤ المحيطة. [18] هذه القوة بين الجزيئات قوية نسبيًا ، وتؤدي إلى الاتجاه البلوري المتكرر للذرات ، والذي يشار إليه أيضًا بنظام الشبكة. هناك عدة أنواع من التكوينات الشبكية الشائعة ، ولكل منها كثافة تعبئة فريدة وقرب ذري. سوف تعيق سحب الإلكترون سالبة الشحنة للأيونات المعدنية التصاق مناطق البروتين سالبة الشحنة بسبب تنافر الشحنة ، مما يحد من مواقع الربط المتاحة للبروتين على سطح معدني.

    يمكن أن يؤدي تكوين الشبكة إلى الاتصال بمواقع التصاق محتملة مكشوفة تعتمد على أيون المعدن (MIDAS) والتي تعد مواقع ربط للكولاجين والبروتينات الأخرى. [19] سطح المعدن له خصائص مختلفة عن الجزء الأكبر لأن الوحدات الفرعية التكرارية البلورية العادية تنتهي عند السطح. هذا يترك ذرات السطح بدون ذرة مجاورة على جانب واحد ، مما يغير توزيع الإلكترون بطبيعته. تفسر هذه الظاهرة أيضًا سبب امتلاك ذرات السطح طاقة أعلى من الكتلة ، وغالبًا ما يشار إليها ببساطة باسم الطاقة السطحية. هذه الحالة من الطاقة الأعلى غير مواتية ، وستحاول ذرات السطح تقليلها عن طريق الارتباط بالجزيئات التفاعلية المتاحة. [20]

    غالبًا ما يتم تحقيق ذلك عن طريق امتصاص البروتين ، حيث يتم تقليل ذرات السطح إلى حالة طاقة أكثر فائدة.

    غالبًا ما يتم تصميم البيئة الداخلية للجسم على أنها بيئة مائية عند 37 درجة مئوية عند درجة الحموضة 7.3 مع الكثير من الأكسجين المذاب ، والإلكتروليتات ، والبروتينات ، والخلايا. [5] عند التعرض للأكسجين لفترة طويلة من الزمن ، قد تتأكسد العديد من المعادن وتزيد من حالة أكسدة سطحها بفقدان الإلكترونات. [21] هذه الحالة الموجبة الجديدة تترك السطح بشحنة موجبة صافية وألفة أعلى لمجموعات البروتين سالبة الشحنة الجانبية. ضمن التنوع الهائل للمعادن والسبائك المعدنية ، يكون العديد منها عرضة للتآكل عند غرسها في الجسم. تتآكل العناصر الأكثر كهرسلبية بشكل أسرع عند تعرضها لبيئة مائية غنية بالكهرباء مثل جسم الإنسان. [22] كل من الأكسدة والتآكل سيقللان من الطاقة الحرة ، وبالتالي يؤثران على امتصاص البروتين كما هو موضح في المعادلة. 1. [23]

    تأثيرات تحرير الطبوغرافيا

    إن خشونة السطح وملمسه لهما تأثير لا يمكن إنكاره على امتصاص البروتين على جميع المواد ، ولكن مع انتشار عمليات تصنيع المعادن في كل مكان ، من المفيد معالجة كيفية تأثير هذه العمليات على سلوك البروتين. الامتزاز الأولي مهم ، وكذلك الحفاظ على الالتصاق والسلامة. أظهرت الأبحاث أن خشونة السطح يمكن أن تشجع التصاق بروتينات السقالة وبانيات العظم ، وتؤدي إلى زيادة تمعدن السطح. [24] السطوح ذات الخصائص الطبوغرافية وخشونة أكثر سيكون بها مساحة سطح مكشوفة أكثر للبروتينات للتفاعل معها. [5] فيما يتعلق بتطبيقات الهندسة الطبية الحيوية ، غالبًا ما تستخدم تقنيات الآلات الدقيقة لزيادة التصاق البروتين بالغرسات على أمل تقصير وقت الاسترداد. تقدم تقنية نمط الليزر الأخاديد وخشونة السطح التي ستؤثر على الالتصاق والهجرة والمحاذاة. أثبتت طريقة السفع بالحصى ، وهي طريقة مماثلة للسفع الرملي ، والحفر الكيميائي أنها تقنيات ناجحة لخشونة السطح تعزز الاستقرار على المدى الطويل لزرع التيتانيوم. [25] الزيادة في الاستقرار هي نتيجة مباشرة للزيادة الملحوظة في المصفوفة خارج الخلية وارتباط الكولاجين ، مما يؤدي إلى زيادة ارتباط بانيات العظم والتمعدن عند مقارنتها بالأسطح غير الخشنة. [26] ومع ذلك ، فإن الامتزاز غير مرغوب فيه دائمًا. يمكن أن تتأثر الآلات سلبًا بالامتزاز ، خاصةً مع امتصاص البروتين في صناعة الأغذية.

    البوليمرات لها أهمية كبيرة عند النظر في امتصاص البروتين في المجال الطبي الحيوي. تتكون البوليمرات من نوع واحد أو أكثر من "المرات" المرتبطة ببعضها البعض بشكل متكرر ، عادة عن طريق روابط تساهمية اتجاهية. مع نمو السلسلة بإضافة mers ، يتم تحديد الخصائص الكيميائية والفيزيائية للمادة بواسطة التركيب الجزيئي للمونومر.من خلال الاختيار الدقيق لنوع أو أنواع المرات في البوليمر وعملية التصنيع الخاصة به ، يمكن تخصيص الخصائص الكيميائية والفيزيائية للبوليمر بدرجة عالية لامتصاص بروتينات وخلايا معينة لتطبيق معين.

    تحرير آثار التشكل

    غالبًا ما يؤدي امتصاص البروتين إلى تغييرات توافقية كبيرة ، والتي تشير إلى التغييرات في الهياكل الثانوية والثالثية والرباعية للبروتينات. بالإضافة إلى معدلات الامتصاص والكميات ، فإن التوجيه والتشكيل لهما أهمية بالغة. يمكن أن تؤثر هذه التغييرات التوافقية على تفاعل البروتين مع الروابط ، والركائز ، والمستضدات التي تعتمد على اتجاه موقع الارتباط محل الاهتمام. هذه التغييرات التوافقية ، نتيجة لامتصاص البروتين ، يمكن أيضًا أن تفسد البروتين وتغير خصائصه الأصلية.

    تحرير الامتزاز إلى سقالات البوليمر

    هندسة الأنسجة هي مجال جديد نسبيًا يستخدم السقالات كمنصة تتكاثر عليها الخلايا المرغوبة. ليس من الواضح ما الذي يحدد السقالة المثالية لنوع معين من الأنسجة. الاعتبارات معقدة وامتصاص البروتين يزيد فقط من التعقيد. على الرغم من أن الهندسة المعمارية والميكانيكا الإنشائية وخصائص السطح تلعب دورًا رئيسيًا ، إلا أن فهم التدهور ومعدل امتصاص البروتين يعد أيضًا أمرًا أساسيًا. بالإضافة إلى أساسيات الميكانيكا والهندسة ، فإن بنية السقالة المناسبة ستمتلك خصائص سطحية محسّنة لربط أنواع الخلايا ذات الأهمية الخاصة وترحيلها.

    بشكل عام ، وجد أن السقالات التي تشبه إلى حد بعيد البيئات الطبيعية للأنسجة التي يتم تصميمها هي الأكثر نجاحًا. نتيجة لذلك ، تم إجراء الكثير من الأبحاث في التحقيق في البوليمرات الطبيعية التي يمكن تكييفها ، من خلال منهجية المعالجة ، نحو معايير تصميم محددة. يعتبر الكيتوزان حاليًا أحد البوليمرات الأكثر استخدامًا لأنه يشبه إلى حد كبير الجليكوزامينوجليكان (GAGs) وهو قابل للتحلل بواسطة الإنزيمات البشرية. [28]

    تحرير الشيتوزان

    الشيتوزان عبارة عن عديد السكاريد الخطي يحتوي على بقايا مشتقة من الكيتين ، وقد تمت دراسته على نطاق واسع باعتباره مادة حيوية نظرًا لتوافقه العالي مع العديد من البروتينات في الجسم. الشيتوزان كاتيوني وبالتالي يتفاعل كهروستاتيكيًا مع العديد من البروتيوغليكان ، و GAGs الأنيونية ، والجزيئات الأخرى التي تمتلك شحنة سالبة. نظرًا لأن العديد من السيتوكينات وعوامل النمو مرتبطة بـ GAG ، فإن السقالات التي تحتوي على مجمعات الشيتوزان-GAG قادرة على الاحتفاظ بهذه البروتينات التي تفرزها الخلايا الملتصقة. هناك نوع آخر من الشيتوزان يمنحه إمكانات جيدة للمواد الحيوية وهو كثافة الشحن العالية في المحاليل. يسمح هذا للكيتوزان بتكوين مجمعات أيونية مع العديد من البوليمرات الأنيونية القابلة للذوبان في الماء ، مما يوسع نطاق البروتينات القادرة على الارتباط به وبالتالي توسيع استخداماته المحتملة. [29]

    بوليمر هيكل سقالة النسيج المستهدف نوع خلية التطبيق المرجع
    الشيتوزان كتل مسامية ثلاثية الأبعاد عظم أوستيوبلاست مثل ROS [30]
    شيتوزان بوليستر شبكات ألياف ثلاثية الأبعاد عظم MSC الإنسان [31]
    الشيتوزان الجينات هلام قابل للحقن عظم أوستيوبلاست شبيهة MG63 [32]
    شيتوزان جيلاتين اسطوانات ثلاثية الأبعاد مسامية غضروف غضروفية [33]
    الشيتوزان- جي بي هلام قابل للحقن غضروف غضروفية [34]
    شيتوزان كولاجين أغشية مسامية جلد الثقافة المشتركة بين الخلايا الليفية والكيراتينية [35]
    الجدول 1: الهياكل والأنسجة المستهدفة وأنواع الخلايا التطبيقية للسقالات القائمة على الشيتوزان

    يعد امتصاص البروتين أمرًا بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات الصناعية والطبية الحيوية. سيسمح التنبؤ الدقيق بامتصاص البروتين بإحراز تقدم في هذه المجالات.

    تحرير قاعدة بيانات الامتزاز الجزيئي الحيوي

    قاعدة بيانات الامتزاز الجزيئي الحيوي (BAD) هي قاعدة بيانات متاحة مجانًا على الإنترنت مع بيانات امتزاز البروتين التجريبية التي تم جمعها من الأدبيات. يمكن استخدام قاعدة البيانات لاختيار المواد اللازمة لتصنيع جهاز ميكروفلويديك ولتحديد ظروف التشغيل المثلى للأجهزة المختبرية على رقاقة. يمكن توقع كمية البروتين الممتص على السطح باستخدام التنبؤ المستند إلى الشبكات العصبية المتاح في BAD. تم التحقق من صحة هذا التوقع ليكون خطأ أقل من 5٪ للبيانات الإجمالية المتاحة في BAD. يمكن أيضًا تقدير المعلمات الأخرى ، مثل سمك طبقات البروتين والتوتر السطحي للأسطح المغطاة بالبروتين. [ بحاجة لمصدر ]


    شاهد الفيديو: الفرق بين الواي بروتين الخام والجاهز (أغسطس 2022).