معلومة

أين يمكنني العثور على تسلسل متجه البلازميد pZ189vector؟

أين يمكنني العثور على تسلسل متجه البلازميد pZ189vector؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحتاج إلى هذا التسلسل لأنه تم استخدامه في هذه الورقة https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/em.1046. يقولون أن البلازميد تم تحضيره كما في هذه الورقة http://www.jbc.org/content/271/16/9637/F1.expansion.html (انظر الشكل أدناه)

ومع ذلك ، لا يبدو أنهم يبلغون عن تسلسل ناقل pZ189. هل يعرف أحد أين يمكنني أن أجد هذا التسلسل؟


اتضح أن التسلسل لم يتم تدوينه فعليًا في أي مكان. سألت أحد المؤلفين الأصليين للبلازميد (وليس الورقة أعلاه) وقال إنه لم يقم أحد بذلك لأنه في الوقت الذي تم فيه استخدام البلازميد كانت مهمة شاقة مع القليل من الفائدة. المشكله :(

وقال أيضًا إن البلازميد pSP189 هو نوع من نفس الشيء ولكنه أكثر كفاءة وما يفعله ، وهو أيضًا أكثر دراية ، مع التسلسل المتاح مجانًا عبر الإنترنت.


كيفية تصميم التمهيدي لتسلسل الحمض النووي غير معروف؟ - (أغسطس / 19/2006)

يتطلب تسلسل الحمض النووي وجود مادة أولية للتهجين إلى خيط واحد من قالب الحمض النووي. لكننا نقوم بترتيب الحمض النووي لأننا لا نعرف التسلسل. إذا كنا لا نعرف التسلسل ، فكيف نصمم بالفعل التمهيدي ؟؟ هل نستخدم البادئات المتدهورة أم.

لقد كنت أقرأ عن تسلسل الحمض النووي لبعض الوقت ولكن ليس لدي فرصة لأدائه (آمل أن يكون يومًا ما).

كل التعليقات والأجوبة مرحب بها

يتم قطع الحمض النووي عادةً باستخدام إنزيمات تقييدية أو عن طريق القص ، ثم يتم ربطه في بلازميد متماثل أو فج. يتم عزل البلازميد للتسلسل. يحتوي البلازميد على متواليات معروفة يمكن استخدامها لبدء عملية التسلسل. للإدخالات القصيرة ، هذا كافٍ. للإدخالات الأطول ، يمكن استخدام نتائج التسلسل لتصميم الاشعال اللاحقة التي تسمح بالتسلسل بشكل أكبر في الإدخال. هذه التقنية تسمى المشي التمهيدي. تُستخدم أحيانًا تقنيات أخرى ، مثل إدخال الينقولات أو الحذف الجزئي للتسلسل.

ولكن لقطع الحمض النووي باستخدام نوكلياز داخلي ، فأنت بحاجة إلى معرفة تسلسل الحمض النووي حتى تعرف أي نوكلياز داخلي يجب استخدامه وأيضًا ما إذا كان التسلسل المحدد موجودًا في الحمض النووي أم لا. والمشكلة الآن أننا لا نعرف التسلسل

هل الحمض النووي الخاص بك هو منتج pcr؟ يمكنك استنساخه في ناقل T-overhang (على سبيل المثال ، pGEM T easy - promega) ثم التسلسل باستخدام البادئات المشتقة من المتجه (T7 ، SP6)

الاحتمال الآخر هو البدء باستخدام مواد أولية مصممة (أو حتى مثبتة) على الحمض النووي للأقارب القريبين من أنواع عينتك. غالبًا ما يستخدم هذا ما يسمى & quot تضخيم الأنواع & quot في علم الوراثة السكانية. ثم تعرف أيضًا المنطقة التي تستخدمها.
بدلاً من ذلك ، يمكنك أيضًا استخدام الاشعال العشوائي (مما يؤدي إلى RAPDs إذا كنت تريد).

(إلى aussieuk) لا. أنا أقرأ فقط عن تسلسل الحمض النووي ولا أفعل ذلك في الواقع.

نظرًا لأن معظم الكتب والمواقع التي عثرت عليها تتحدث عن كيفية استخدام البادئات و ddNTPs وتقنية pcr لتشغيل تسلسل إنهاء السلسلة ، أتساءل فقط هل هذه هي التقنية المستخدمة لتسلسل & quotfirst & quot DNA seqeunce؟

لأنك تحتاج إلى معرفة على الأقل & amp ؛ بعض التسلسلات & quot للحمض النووي من أجل ترتيب تسلسل الآخرين. سؤالي هو ، كيف يحصل العلماء على & quot أول تسلسل للحمض النووي؟

هناك العديد من الطرق. غالبًا ما يبدأ بنمط ظاهري تم إنشاؤه أو يحدث بشكل طبيعي ، والذي تتم دراسته بطرق مختلفة لإنتاج الجين (الجينات) المسؤول. هذا موضوع واسع للغاية وهناك العديد من الأساليب. في بعض الأحيان يبدأ بالبروتينات الطافرة ويعمل بشكل عكسي ، وأحيانًا يتضمن صنع الطفرات ودراستها. على سبيل المثال ، يمكن أن تعطي السلالات بالضربة القاضية مؤشرات جيدة لوظيفة الجينات. إذا تم إنشاء الضربات القاضية باستخدام طفرات الينقولات ، فمن الممكن عندئذٍ استنساخ التسلسلات المجاورة للإدخالات ودراسة & # 39first DNA & # 39.

هل هذا ساعد؟ هل كان لدي أي معنى؟

(إلى aussieuk) لا. أنا أقرأ فقط عن تسلسل الحمض النووي ولا أفعل ذلك في الواقع.

نظرًا لأن معظم الكتب والمواقع التي عثرت عليها تتحدث عن كيفية استخدام البادئات و ddNTPs وتقنية pcr لتشغيل تسلسل إنهاء السلسلة ، أتساءل فقط هل هذه هي التقنية المستخدمة لتسلسل & quotfirst & quot DNA seqeunce؟

لأنك تحتاج إلى معرفة على الأقل & amp ؛ بعض التسلسلات & quot للحمض النووي من أجل ترتيب تسلسل الآخرين. سؤالي هو ، كيف يحصل العلماء على & quot أول تسلسل للحمض النووي؟

(ل aimikins) نعم ، هذا منطقي المحافظ.

آسف ، أعتقد أنني لم أجعل السؤال واضحًا بدرجة كافية ، أو ربما عنواني مضلل.

بالعودة إلى سنوات عديدة مضت ، عندما لم تكن هناك قواعد بيانات منشورة أو سويسرية أو قواعد بيانات أخرى ، من كان أول عالم يقوم بتشكيل الحمض النووي وكيف فعل ذلك؟

(ل aimikins) نعم ، هذا منطقي المحافظ.

آسف ، أعتقد أنني لم أجعل السؤال واضحًا بدرجة كافية ، أو ربما عنواني مضلل.

بالعودة إلى سنوات عديدة مضت ، عندما لم تكن هناك قواعد بيانات منشورة أو سويسرية أو قواعد بيانات أخرى ، من كان أول عالم يقوم بتشكيل الحمض النووي وكيف فعل ذلك؟

أفهم سؤالك تمامًا لأنني ما زلت أشعر بعدم الارتياح للإجابة عليه. نظرًا لأنك أعدت صياغة سؤالك الآن ، فإن الناس سيفهمون كثيرًا بسهولة. أنا & # 39ll تضمين الرد من قبل phage434

نظرًا لأننا لا نعرف التسلسل ، فسنقوم بالهضم بأي إنزيم تقييد واحد ، بغض النظر عما إذا كنا نعرف تسلسل هذا الإنزيم أم لا ، فسوف نقوم بهضمه مرتين على الأقل أم لا. لماذا مرتين على الأقل؟ لذلك يجب أن نحصل على شريطين مختلفين من الحمض النووي بحجم كيلو بايت. إذا لم يقطع الإنزيم & # 39t أو أنه يعطي نطاقًا صغيرًا جدًا على الفصل الكهربائي للهلام والذي لا يمكن اكتشافه أو يصعب عزله بعد ذلك. ببساطة استخدم إنزيم تقييد آخر. وإذا حصلنا على أكثر من شريطين في الفصل الكهربائي للهلام ، فسيكون لدينا خيار اختيار التشبيه. في هذه اللحظة ، لا يهم ما إذا كنا نعرف موقع إنزيم التقييد ، كما ذكرت أننا لا نعرف تسلسل & # 39unknown DNA & # 39. إنه مجرد اختيار عشوائي & # 33

بعد اختيار نطاق من الفصل الكهربائي للهلام مع تسلسل غير معروف ، يمكننا استخدام طرق مختلفة الآن. يمكن للمرء أن يدمجه في ناقل مكوك بتسلسل معروف. تم إنشاء هذا المتجه من قبل البشر أو على الأقل يعرفون التسلسل ونعرف مكان وضع الإدخال (المعروف باسم موقع الاستنساخ المتعدد ، MCS). هناك بناء / بلازميد مختلف متاح. بعد وضع الفرقة UNKNOWN في المتجه ، يمكننا تحويلها إلى بكتيريا لتنمية كميات أكبر من الناقل ، والتي تسمى الآن البلازميد الذي تم عزله عن المادة الهلامية UNKNOWN BAND. يمكننا الآن صنع زوج من البادئات (للأمام والخلف) من العمود الفقري البلازميدي الخاص بنا فقط على طرفي إدخالنا (نعرف تسلسل البلازميد ، تذكر & # 33). ثم ببساطة عن طريق إجراء PCR سيعطي كمية أكبر من UNKNOWN BAND فقط. الآن قم بعمل التسلسل للعثور على التسلسل. بعد ذلك ، لا نحتاج إلى تكرار هذه العملية ، ما عليك سوى استخدام UNKNOWN BAND (الآن نعرف التسلسل) لصنع البادئات والاستمرار.


أين يمكنني العثور على تسلسل ناقل البلازميد pZ189vector؟ - مادة الاحياء

لتخليق الجينات ، فقط
يومين و 49 دولارًا

تصميم جرنا مجاني 199 دولارًا / بناء

** هذه أداة برمجية لإنشاء تسلسل مختلط كعنصر تحكم سلبي لتجربة siRNA الخاصة بك.

تعليمات: تم تصميم هذا البرنامج لإنشاء عنصر تحكم سلبي لـ siRNA. يقبل تسلسل DNA قصيرًا (& lt = 30 mer) ، ويعيد تسلسلًا مشوشًا.

سيكون للتسلسل المشوش الميزات التالية:

  • لها نفس تركيبة النوكليوتيدات مثل تسلسل الإدخال.
  • اجتاز نفس ترشيح siRNA (على سبيل المثال لا يوجد تسلسل معقد منخفض).
  • وجود أضعف (أو لا) يتطابق مع أي مرنا في تجمع الرنا المرسال لكائن حي معين.

سنحاول ما يصل إلى 1000000 مجموعة لعملية التدافع لتحديد مرشح جيد حقًا.


أين يمكنني العثور على تسلسل متجه البلازميد pZ189vector؟ - مادة الاحياء

معلومات حول طرق الاستنساخ

وصف
في استنساخ إنزيم التقييد القياسي (RE) ، تُستخدم إنزيمات محددة لشق الحمض النووي في تسلسلات محددة من الحمض النووي ، ويتم ربط الأجزاء ذات الأطراف المتوافقة (أو الأجزاء غير الحادة) ببعضها البعض لتشكيل بلازميد دائري ، يمكن تحويله ونشره في البكتيريا. يمكن استخدام الطريقة لإضافة أو إزالة أو معالجة تسلسل الحمض النووي.

يتعلم أكثر
لمعرفة المزيد حول هذه الطريقة ، يرجى الرجوع إلى كتاب علم الأحياء الجزيئي أو دليل البروتوكول.

مزايا
من المزايا المهمة لاستنساخ الطاقة المتجددة أنه نظرًا لاستخدامه لسنوات عديدة ، فإن الكواشف والبروتوكولات متاحة بسهولة لمعظم الباحثين.

في PlasmID
يمكن معالجة أي بلازميد تقريبًا باستخدام طرق استنساخ إنزيم التقييد. مفيدة بشكل خاص هي تلك البلازميدات التي تحتوي على مواقع استنساخ متعددة (MCS) ، وتسمى أيضًا الرابط المتعدد.

وصف
يتعرف إنزيم CpoI (المتوفر من Fermentas والموردين الآخرين) على التسلسل cggtccg أو cggaccg. يقطع الإنزيم بعد أول cg ، تاركًا ثلاثة أزواج أساسية من ثلاثة أزواج أساسية. هذه الخصائص تجعل من الممكن استخدام CpoI لاستنساخ شظايا مكبرة PCR مصممة خصيصًا في الإطار وبشكل مباشر في ناقل CpoI المهضوم. يمكن استخدام نهج CpoI لإضافة إدخالات إلى متجه مع موقع استنساخ aCpoI.

يتعلم أكثر
لمعرفة المزيد حول هذه الطريقة ، راجع الأوراق التي تستخدم هذه الطريقة ، مثل Petrucco et al. (2002) & quotA Nick-sensing 3 'إنزيم إصلاح الحمض النووي من Arabidopsis & quot (PMID: 11948185) ، Izumiya et al. (2003) & quot تنظيم دورة الخلية. & quot (PMID: 12915577) أو Izumiya et al. (2005) & quot؛ Kaposi's sarcoma المرتبطة. & quot (بميد: 16014952). بالإضافة إلى ذلك ، من المفيد استخلاص نهايات المتجه ومنتج PCR لمعرفة كيفية عمل الطريقة.

مزايا
تشمل المزايا المهمة لطريقة الاستنساخ الاتجاهي القائمة على CpoI مقارنة بأساليب هضم التقييد التقليدية (1) نظرًا لأن الجزء المتدلي يتكون من ثلاثة أزواج أساسية ، ومن السهل الاحتفاظ بالأشياء في الإطار ، و (2) يمكن استخدام إنزيم واحد في اتجاه (تتطلب معظم الأساليب الاتجاهية قطع أحد الطرفين بإنزيم تقييد واحد ويتم قطع الطرف الآخر باستخدام إنزيم تقييد مختلف).

في PlasmID
تمت مشاركة العديد من البلازميدات مع المستودع بواسطة J. Kamil (مختبر D. Coen ، قسم BCMP في كلية الطب بجامعة هارفارد) والتي تفيد في إضافة علامات N-terminal و C-terminal (على سبيل المثال 6xHis و T7 eptiope tags). جرب & quot المتقدم بحث & quot مع & quotKamil & quot كمؤلف أو حاول & quotsearch بواسطة vector & quot واختر & quot الاستنساخ المستند إلى CpoI & quot كطريقة للاستنساخ.

وصف
يمكن استخدام نظام Clontech's Creator (TM) وغيره من البلازميدات المحتوية على موقع LoxP لإضافة أو استبدال أو معالجة الحمض النووي بطريقة أخرى باستخدام إنزيم Cre ، الذي يحفز إعادة التركيب الخاص بالموقع في مواقع LoxP. يرجى ملاحظة أنه ليس كل ناقل يحتوي على LoxP مناسب لنهج الاستنساخ المستندة إلى Cre / Lox. في بعض الأحيان ، يكون LoxP موجودًا لإتاحة بعض الأساليب التجريبية التي لا علاقة لها بالاستنساخ (على سبيل المثال ، يتم إدخال التركيبات المحتوية على LoxP في بعض الأحيان في الخلايا ثم يتم استخدام التعبير في الجسم الحي لـ Cre لإحداث تغييرات).

يتعلم أكثر
لمعرفة المزيد حول هذه الطريقة ، يرجى الاطلاع على موقع Clontech الإلكتروني www.clontech.com والمراجع المناسبة ، والتي تشمل Hoess et al. (1982) & quotP1 إعادة التركيب الخاص بالموقع: تسلسل النيوكليوتيدات لمواقع إعادة التركيب & quot (معرف PubMed 6954485.).

مزايا
من المزايا المهمة للنظام أنه يمكن استنساخ الملحق في ناقل "رئيسي" أو "إدخال" واحد ويتم استنساخه بسهولة في العديد من نواقل التعبير المختلفة دون الحاجة إلى الهضم باستخدام إنزيمات التقييد ، وتنقية الهلام ، والربط ، وما إلى ذلك.

في PlasmID
تمت مشاركة العديد من إطارات القراءة المفتوحة (ORF) أو cDNA المستنسخة في pDNR-Dual مع المستودع بواسطة معهد هارفارد للبروتيوميات (HIP) في كلية الطب بجامعة هارفارد. بعض هذه الحيوانات المستنسخة & quot ؛ تنسيق & quot ؛ بحيث يكون كود الإيقاف العادي موجودًا والبعض الآخر عبارة عن تنسيق & quotfusion & quot حيث يتم استبدال كود الإيقاف بكودون leu بحيث يمكن إضافة علامة C-terminal.

وصف
يمكن استخدام نظام Invitrogen's Gateway (TM) وغيره من البلازميدات المحتوية على إعادة تركيب lambda (att) لإضافة أو استبدال أو معالجة الحمض النووي بطريقة أخرى باستخدام إنزيم يحفز إعادة التركيب الخاصة بالموقع في مواقع من النوع Att.

يتعلم أكثر
لمعرفة المزيد حول هذه الطريقة ، يرجى الاطلاع على موقع Invitrogen على الويب www.invitrogen.com والمراجع المناسبة ، والتي تشمل Landy (1989) & quotDynamic ، والجوانب الهيكلية والتنظيمية لإعادة التركيب الخاصة بموقع lambda & quot (معرف PubMed 2528323).

مزايا
على غرار نهج Cre / Lox ، تتمثل إحدى الميزات المهمة للنظام في أنه يمكن استنساخ الملحق في ناقل "رئيسي" أو "إدخال" واحد ويمكن استنساخه بسهولة في العديد من نواقل التعبير المختلفة دون الحاجة إلى الهضم باستخدام إنزيمات التقييد ، جل تنقية ، ربط ، إلخ.

في PlasmID
تتضمن الأمثلة عددًا كبيرًا جدًا من إطارات القراءة المفتوحة (ORF) أو cDNA المستنسخة في pDONR201 أو pDONR221 التي تمت مشاركتها مع المستودع بواسطة معهد هارفارد للبروتيوميات (HIP) في كلية الطب بجامعة هارفارد. بعض هذه الحيوانات المستنسخة & quot ؛ تنسيق & quot ؛ بحيث يكون كود الإيقاف العادي موجودًا والبعض الآخر عبارة عن تنسيق & quotfusion & quot حيث يتم استبدال كود الإيقاف بكودون leu بحيث يمكن إضافة علامة C-terminal.

وصف
& quotMating-Assisted-Assisted Genoning & quot أو MAGIC تم تطويره بواسطة Li & amp Elledge (HHMI / Harvard Medical School) ويعتمد على انقسام الحمض النووي في الجسم الحي وأحداث إعادة التركيب المتماثلة التي تحدث أثناء التزاوج البكتيري للجمع بين البلازميدات المصممة خصيصًا لـ "المتبرع" و "المستلم" ( على سبيل المثال ، الجهات المانحة المحتوية على إدراج وناقلات التعبير الخاصة بالمستلمين).

يتعلم أكثر
لمعرفة المزيد حول هذه الطريقة ، يرجى الاطلاع على Li & amp Elledge (2005) & quotMAGIC ، وهي طريقة وراثية في الجسم الحي لبناء سريع لجزيئات الحمض النووي المؤتلف & quot (معرف PubMed 15731760).

مزايا
من المزايا المهمة لهذه الطريقة أن البكتريا تقوم بعمل الجمع بين المدخلات والنواقل ، وبالتالي ، يمكن إنشاء التركيبات دون الحاجة إلى هضم إنزيم التقييد ، وتنقية الهلام ، وما إلى ذلك أو استخدام إنزيمات تعزيز إعادة التركيب.

في PlasmID
تتضمن الأمثلة مجموعة النسخ المستنسخة pPRIME- (علامة) -المستقبل للنُهج المستندة إلى shRNA والتي تمت مشاركتها مع المستودع بواسطة مختبر Elledge (HHMI / كلية الطب بجامعة هارفارد).

الأحكام والشروط
2004-2018 كلية الطب بجامعة هارفارد
تم إنشاء PlasmID والمحافظة عليه من قبل DF / HCC DNA Resource Core في كلية الطب بجامعة هارفارد


الاستنساخ والبيولوجيا الاصطناعية

يتم تحضير الحمض النووي ذي الأهمية ، مثل الجين ، أو العنصر (العناصر) التنظيمية ، أو الأوبون ، وما إلى ذلك ، للاستنساخ عن طريق إزالته من مصدر الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد ، أو نسخه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، أو التجميع من قليل النوكليوتيدات الفردية. في الوقت نفسه ، يتم تحضير ناقل البلازميد في شكل خطي باستخدام إنزيمات التقييد أو تفاعل البوليميراز المتسلسل. البلازميد عبارة عن قطعة دائرية صغيرة من الحمض النووي تتكرر داخل العائل ، وهي موجودة بشكل منفصل عن الكروموسومات أو الحمض النووي الجيني للمضيف. من خلال الانضمام المادي للحمض النووي ذي الأهمية لناقل البلازميد من خلال روابط الفوسفوديستر ، يصبح الحمض النووي محل الاهتمام جزءًا من البلازميد المأشوب الجديد ويتم تكراره بواسطة المضيف.

تسمح نواقل البلازميد بنسخ الحمض النووي ذي الأهمية بكميات كبيرة ، وغالبًا ما توفر عناصر التحكم اللازمة لاستخدامها لتوجيه نسخ وترجمة الحمض النووي المستنسخ. على هذا النحو ، فقد أصبحوا العمود الفقري للعديد من الأساليب الجزيئية ، مثل التعبير عن البروتين ، ودراسات التعبير الجيني ، والتحليل الوظيفي للجزيئات الحيوية.

أثناء عملية الاستنساخ ، يجب تعديل نهايات الحمض النووي موضع الاهتمام والناقل لجعلهما متوافقين للانضمام من خلال عمل DNA ligase أو recombinase أو في الجسم الحي آلية إصلاح الحمض النووي. تستخدم هذه الخطوات عادةً إنزيمات ، مثل نوكليازات ، فوسفاتازات ، كينازات و / أو ليغازات. تم تطوير العديد من منهجيات الاستنساخ ، ومؤخراً مجموعات أدوات لتبسيط هذه العمليات وتوحيدها.

استخدم NEBcloner للعثور على المنتجات والبروتوكولات المناسبة لكل خطوة استنساخ.

تاريخ الاستنساخ

تعرف على المزيد حول الأنواع المختلفة للاستنساخ الجزيئي الموجودة في سير العمل أدناه: الاستنساخ التقليدي ، استنساخ PCR ، الاستنساخ السلس ، الاستنساخ المستقل للربط (LIC) والاستنساخ التأشبي.

سير عمل الاستنساخ

علم الأحياء الاصطناعية
البيولوجيا التركيبية هي توسع أحدث في مجال التكنولوجيا الحيوية ، حيث يُنظر إلى الجينات والبروتينات كأجزاء أو أجهزة ، بهدف إعادة تصميم و / أو تجميع هذه الأجزاء بطرق جديدة لإنشاء وظيفة جديدة ومفيدة. إن التطورات الحديثة في توليد الوقود الحيوي ، وإنتاج المواد الكيميائية الحيوية ، وفهم الحد الأدنى من الجينوم ، كلها تستفيد من الأساليب البيولوجية التركيبية. غالبًا ما تعتمد هذه المشاريع على التجميع المنظم لتسلسلات الحمض النووي المتعددة لإنشاء هياكل DNA اصطناعية كبيرة. تحقيقا لهذه الغاية ، تطورت الأساليب لتبسيط هذه العملية. يمكن استخدام NEBuilder & reg HiFi DNA Assembly و Golden Gate Assembly لإنشاء العديد من هياكل الحمض النووي الوظيفية ، بدءًا من الانضمام البسيط لجينين من الجينات الأيضية ، وصولاً إلى إنشاء جينوم اصطناعي.

للمساعدة في تحديد أفضل طريقة لتجميع الحمض النووي لاحتياجاتك ، يرجى استخدام مخطط اختيار تجميع البيولوجيا التركيبية / الحمض النووي الخاص بنا.


التكنولوجيا الحيوية: ملاحظات مفيدة على التكنولوجيا الحيوية التقليدية والحديثة

تتعامل التكنولوجيا الحيوية مع تقنيات استخدام الكائنات الحية الدقيقة أو الخلايا النباتية أو الحيوانية أو مكوناتها أو الإنزيمات من الكائنات الحية لإنتاج منتجات وعمليات (خدمات) مفيدة للبشر.

مصطلح التكنولوجيا الحيوية صاغه المهندس المجري كارل إريكي في عام 1917 لوصف عملية إنتاج الخنازير على نطاق واسع.

التلاعب الجيني هو علم سريع الظهور. بدأت بتطوير جزيئات الحمض النووي المؤتلف. يتم تسميته بشكل مختلف باسم التكنولوجيا الحيوية لمعالجة الحمض النووي وتقنية الحمض النووي المؤتلف والهندسة الوراثية.

تتضمن التقنية في الغالب قطع ولصق شظايا الحمض النووي المرغوبة. يعتمد على اكتشافين مهمين في البكتيريا:

(ط) وجود البلازميدات في البكتيريا التي يمكن أن تخضع للتكاثر جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي الصبغي ومستقلًا عنه.

(2) نوكليازات مقيدة (Arber، Nathan and Smith 1970 Nobel Prize in 1978) والتي يمكن أن تكسر الحمض النووي في مواقع محددة.

يطلق عليهم بشكل مناسب المقص الجزيئي. كان بيرج (1972) قادرًا على إدخال جين من SV-40 في البكتيريا بمساعدة العاثية لامدا. غالبًا ما يُعتبر بيرج "أب الهندسة الوراثية". حصل على جائزة نوبل في عام 1980. ظهر علم التكنولوجيا المؤتلفة عندما تمكن كوهين وبوير (1973) من إدخال قطعة من الجين تحتوي على دنا غريب في بلازميد الإشريكية القولونية.

التكنولوجيا الحيوية القديمة (التكنولوجيا الحيوية التقليدية):

تم استخدام الكائنات الحية الدقيقة لأول مرة لإنتاج بعض المركبات العضوية مثل حامض الستريك. كما تم استخدامها لإنتاج الأجسام المضادة. تم تحسين مستويات إنتاج البنسلين ولكن أنواع المنتجات لم تتغير. تظل هي نفسها التي تم الحصول عليها من السلالات / خطوط الخلايا الطبيعية. في كل هذه العمليات ، يتم استغلال القدرات الطبيعية للكائنات الحية والخلايا فقط. هذه الأنشطة تسمى التقانة الحيوية القديمة.

التكنولوجيا الحيوية الحديثة:

يتم إنتاج الأنسولين البشري أيضًا من صبغة الإشريكية القولونية المعدلة وراثيًا والتي تحتوي على جين الأنسولين ويعبر عنه. تسمى البروتينات التي تنتجها الجينات المحورة بالبروتينات المؤتلفة. تسمى تقنيات الإنتاج القائمة على الهندسة الوراثية بالتكنولوجيا الحيوية الحديثة. تم تطويره خلال عام 1970.

تعريف التكنولوجيا الحيوية:

قدم الاتحاد الأوروبي للتكنولوجيا الحيوية (EFB) تعريفًا للتكنولوجيا الحيوية يغطي كلاً من الآراء التقليدية والتكنولوجيا الحيوية الجزيئية الحديثة. وفقًا لـ EFB. "التكنولوجيا الحيوية هي الاستخدام المتكامل للكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة والعلوم الهندسية من أجل تحقيق التطبيق التكنولوجي (الصناعي) لقدرات الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة / الخلايا المستزرعة وأجزاء منها". وبالتالي فإن تعريف التكنولوجيا الحيوية يتضمن عاملين مشتركين. أولاً استخدام العوامل البيولوجية وثانياً يتم إنشاء المنتج أو الخدمة لرفاهية البشر

أنا. مبادئ التكنولوجيا الحيوية:

تقنيتان رئيسيتان للتكنولوجيا الحيوية الحديثة:

التقنيتان الرئيسيتان اللتان ولدت فيهما التكنولوجيا الحيوية الحديثة هما كما يلي:

(أ) الهندسة الوراثية:

يتضمن تقنيات لتغيير طبيعة المواد الجينية (DNA و RNA) لإدخالها في الكائنات الحية المضيفة وبالتالي تغيير النمط الظاهري للكائن الحي المضيف.

(ب) الهندسة الكيميائية:

يتضمن الحفاظ على حالة خالية من التلوث الجرثومي المعقمة في عمليات الهندسة الكيميائية لنمو الكائنات الحية الدقيقة / خلية حقيقية النواة بكميات كبيرة فقط لتصنيع منتجات التكنولوجيا الحيوية مثل المضادات الحيوية واللقاحات والإنزيمات والأدوية والهرمونات ، إلخ.

1. التطوير المفاهيمي لمبادئ الهندسة الوراثية:

الهندسة الوراثية هي نوع من التكنولوجيا الحيوية التي تتعامل مع معالجة الإنسان للمادة الوراثية في المختبر.

تعتمد الهندسة الوراثية على اكتشافين مهمين في البكتيريا.

(ط) وجود البلازميدات في البكتيريا التي يمكن أن تخضع للتكاثر جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي الصبغي ومستقلًا عنه.

(2) نوكليازات مقيدة (Arber، Nathan and Smith 1970 Nobel Prize in 1978) والتي يمكن أن تكسر الحمض النووي في مواقع محددة. يطلق عليهم بشكل مناسب المقص الجزيئي أو المقص البيولوجي.

في عام 1972 بدأ بول بيرج الهندسة الوراثية. كان بيرج (1972) قادرًا على إدخال جين من فيروس SV-40 في بكتيريا بمساعدة العاثية لامدا. غالبًا ما يُعتبر بيرج "أب الهندسة الوراثية". حصل على جائزة نوبل عام 1980.

تشمل تقنية الهندسة الوراثية:

(ط) تكوين "الحمض النووي المؤتلف" (rDNA).

(3) نقل الجينات. يسمح بعزل وإدخال واحد فقط أو مجموعة من الجينات المرغوبة دون إدخال جينات غير مرغوب فيها إلى الكائن المستهدف.

قطعة من الحمض النووي التي يتم إدخالها إلى الكائن الغريب (الأجنبي) لن تكون قادرة على التكاثر في الكائن الحي ولكن عندما يتم دمجها في المادة الوراثية للمتلقي ، فإنها قد تتكاثر وتورث مع الحمض النووي للمضيف ، لأن أصبحت القطعة الغريبة من الحمض النووي جزءًا من الكروموسوم الذي يمتلك القدرة على التكاثر.

هناك تسلسل DNA محدد يسمى أصل النسخ المتماثل في الكروموسوم المسؤول عن بدء النسخ المتماثل. وبالتالي ، يمكن للحمض النووي الغريب المرتبط بأصل النسخ المتماثل أن يتكاثر ويتكاثر في الكائن الحي المضيف. ويسمى أيضًا الاستنساخ ، أي تكوين نسخ متطابقة متعددة من أي قالب DNA.

2. بناء أول جزيء الحمض النووي المؤتلف الاصطناعي:

تم بناء أول DNA مؤتلف بواسطة ستانلي كوهين وهربرت بوير في عام 1972. لقد قطعوا قطعة من الحمض النووي من البلازميد الذي يحمل الجين المقاوم للمضادات الحيوية في بكتيريا السالمونيلا تيفيموريوم. تم قطع قطعة من الحمض النووي من البلازميد بمساعدة الإنزيمات المقيدة (وتسمى أيضًا المقص الجزيئي أو المباضع الكيميائية).

تم ربط قطعة الحمض النووي الغريبة المقطوعة من البلازميد مع DNA البلازميد الذي يعمل كناقل. تم ربط قطعة من الحمض النووي الغريب بالناقل بمساعدة إنزيم DNA ligase الذي يعمل على قطع جزيئات الحمض النووي وربط نهاياتها. يسمى هذا الحمض النووي المكون حديثًا والذي يحتوي على جزء متكامل من الجين المقاوم للمضادات الحيوية باسم الحمض النووي المؤتلف.

يتم استخدام النواقل لنقل الحمض النووي المؤتلف إلى الإشريكية القولونية. يشبه هذا النقل للحمض النووي المؤتلف نقل طفيلي الملاريا من الشخص المريض إلى الشخص السليم من خلال أنثى بعوضة الأنوفيلة (تعمل كناقل للحشرات).

عندما يتم نقل هذا الحمض النووي المؤتلف إلى الإشريكية القولونية ، يمكن أن يتكاثر في الخلية المضيفة الجديدة في وجود إنزيم بوليميريز الحمض النووي ويصنع نسخًا متعددة من الحمض النووي المؤتلف. القدرة على مضاعفة نسخ الجين المقاوم للمضادات الحيوية في E. coli يسمى استنساخ الجين المقاوم للمضادات الحيوية في E. coli.

ثلاث خطوات أساسية في تكوين كائن معدل وراثيا (GMO) أو كائن حي معدل وراثيا. تحتوي الكائنات المعدلة وراثيًا على جين / جزء غريب من الحمض النووي. هذه الخطوات الأساسية الثلاث هي كما يلي.

(ط) تحديد الحمض النووي مع الجينات المرغوبة.

(2) إدخال الحمض النووي المحدد في المضيف.

(3) الحفاظ على الحمض النووي الذي تم إدخاله في المضيف ونقل الحمض النووي إلى ذريته.

ثانيًا. أدوات تقنية الحمض النووي المؤتلف:

تستخدم ثلاثة أنواع من & # 8220 الأدوات البيولوجية & # 8221 في تكوين الحمض النووي المؤتلف. هذه كالتالي:

(ب) نواقل الاستنساخ (الحمض النووي للمركبة)

(ج) مضيف كفؤ (للتحول باستخدام الحمض النووي المؤتلف)

تستخدم هذه الإنزيمات لفتح الخلايا للحصول على الحمض النووي للتجارب الجينية. عادة ما يستخدم الليزوزيم لإذابة جدار الخلية البكتيرية. في الخلية النباتية ، يتكون جدار الخلية من السليلوز ، بينما في الفطريات ، يتكون من الكيتيناز.

تستخدم هذه الإنزيمات لكسر جزيئات الحمض النووي. هم من ثلاثة أنواع - نوكليازات خارجية ، نوكليازات داخلية و نوكليازات تقييدية.

يقومون بإزالة النيوكليوتيدات من الأطراف الطرفية (إما 5 & # 8242 أو 3 & # 8242) من الحمض النووي في خيط واحد من الطباعة على الوجهين.

يقومون بعمل جروح في موضع محدد داخل الحمض النووي. لا تشق هذه الإنزيمات النهايات وتتضمن فقط خيطًا واحدًا من DNA مزدوج الاتجاه.

(ج) تقييد نوكلياز:

قطعوا الحمض النووي المزدوج في نقاط محددة. تسمى نهاياتها الحرة المفردة المجدولة "النهايات اللاصقة" (الشكل 11.3) والتي يمكن ربطها من طرف إلى آخر بواسطة روابط DNA.

نوكليازات تقييدية - المقص الجزيئي:

تم عزل نوكلياز التقييد لأول مرة بواسطة W. Arber في عام 1962 في البكتيريا. يطلق عليهم اسم "المقص الجزيئي أو المقص البيولوجي". في عام 1978 ، مُنح Arber و Smith و Nathan جائزة نوبل لاكتشافها نوكلياز مقيد.

يتعرفون على التسلسل الأساسي في مواقع متناظرة في DNA مزدوج ويقطعوا خيوطه. على سبيل المثال ، يتعرف نوكلياز القيد الداخلي EcoR 1 الموجود في بكتيريا القولون E. coli على التسلسل الأساسي GAATTC في DNA مزدوج الاتجاه ويقطع خيوطه بين G و A كما هو موضح أدناه: تستخدم فقط إنزيمات التقييد من النوع الثاني في معالجة الجينات لسببين ،

(أ) لا حاجة إلى ATP لعمل الشق ،

(ب) يقوم بعمل انشقاق أو قطع في كل من خيوط جزيء الحمض النووي.

(1) أنواع نوكليازات التقييد:

هناك ثلاثة أنواع رئيسية من نوكليازات التقييد هي النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث.

نوكليازات تقييد من النوع الأول:

تتكون هذه الإنزيمات من 3 وحدات فرعية مختلفة. أنها تتطلب ATP و Mg 2+ و S-adenosyl methionine للتقييد. تتعرف نوكليازات التقييد من النوع الأول على مواقع محددة داخل الحمض النووي ولكن لا تقطع هذه المواقع. وبالتالي لا يتم استخدامها في تقنية الحمض النووي المؤتلف.

نوكليازات تقييد من النوع الثاني:

هذه الإنزيمات بسيطة وتتطلب Mg 2+ أيونات للتقييد. من بين الأنواع الثلاثة ، يتم استخدام إنزيمات تقييد النوع الثاني فقط في تقنية الحمض النووي المؤتلف.

نوكليازات تقييد Тyре III:

تتكون هذه الإنزيمات من وحدتين فرعيتين مختلفتين. أنها تتطلب ATP و Mg 2+ و S-adenosyl methionine للتقييد. إنها تتعرف على مواقع محددة داخل الحمض النووي ولكنها لا تقطع هذه المواقع ، وبالتالي ، لا يتم استخدام نوكليازات التقييد هذه في تقنية الحمض النووي المؤتلف. لديهم خصائص وسيطة بين النوع الأول والنوع الثاني.

الاختلافات بين نوكليازات تقييد Тyре I و Тyре II و Type III:

النوع I النوع الثاني Тyре III
1. يتكون هيكل الإنزيم من 3 وحدات فرعية مختلفة. هيكل الإنزيم بسيط. يتكون هيكل الإنزيم من وحدتين فرعيتين مختلفتين.
2. أنها تتطلب ATP ، Mg 2+ S-adenosyl-methionine للتقييد. تتطلب أيونات Mg 2+ للتقييد. أنها تتطلب ATR Mg 2+ و S-adenosyl ، ميثيونين للتقييد.
3. يتعرفون على مواقع محددة داخل الحمض النووي لكنهم لا يقطعون هذه المواقع. يتعرفون على مواقع محددة داخل الحمض النووي ويقطعون هذه المواقع. يتعرفون على مواقع محددة داخل الحمض النووي لكنهم لا يقطعون هذه المواقع.
4. لا يتم استخدامها في تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف. يتم استخدامها في تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف. لا يتم استخدامها في تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف.

(2) تسمية إنزيمات التقييد:

(ط) تتم تسمية إنزيمات التقييد من النوع الثاني باسم البكتيريا التي تم عزلها منها ،

(2) الحرف الأول المستخدم للإنزيم هو الحرف الأول من اسم جنس البكتيريا (بخط مائل) ،

(3) ثم يأتي الحرفان الأولان من نوعه (بخط مائل أيضًا) ،

(4) الحرف الرابع من اسم الإنزيم هو الحرف الأول من السلالة. هو مكتوب في العاصمة ،

(5) تشير نهاية الاسم إلى الترتيب الذي تم به عزل الإنزيم. هو مكتوب بالرقم الروماني. على سبيل المثال ، تم عزل الإنزيم Eco R1 من بكتيريا Escherichia coli RY13. تم تسمية Enzyme Eco R1 على النحو التالي.

الحرف الكبير E يأتي من جنس Escherichia. الحروف со. هي من الأنواع القولونية. الحرف R مأخوذ من RY13 (سلالة). يشير الرقم الروماني 1 إلى أنه كان أول إنزيم تم عزله من بكتيريا E. coli RY13. أدى اكتشاف إنزيمات نوكلياز المقيدة إلى الحصول على جائزة نوبل لو.أربير ، هـ. سميث ، ود. ناثان في عام 1978.

يتم إعطاء بعض الأمثلة على إنزيمات النوع الثاني في الجدول 11.1 الذي يوضح أسماء إنزيمات التقييد (نوكليازات داخلية) ، والمصدر (الكائن الحي الذي تم عزله منه) ، وتسلسل التعرف عليها وموقع الانقسام.

(3) عمل نوكلياز تقييد:

تم وضع أسس الحمض النووي المؤتلف (rDNA) من خلال اكتشاف إنزيمات التقييد. توجد هذه الإنزيمات في العديد من البكتيريا حيث تعمل كجزء من آلية دفاعها تسمى نظام تعديل التقييد. تم شرح الأساس الجزيئي لهذا النظام لأول مرة بواسطة Wemer Arber في عام 1965.

يتكون نظام تعديل التقييد من مكونين

(ط) إنزيم التقييد الذي يحدد الحمض النووي الأجنبي الذي تم إدخاله ويقطع إلى أجزاء تسمى نوكليازات التقييد. يشير مصطلح "التقييد" إلى وظيفة هذه الإنزيمات في تقييد انتشار الحمض النووي الغريب للعاثيات (الفيروسات التي تهاجم البكتيريا) في البكتيريا المضيفة ،

(2) المكون الثاني هو إنزيم تعديل يضيف مجموعة ميثيل إلى قاعدة أو قاعدتين عادة "ضمن" التسلسل المعاد تنظيمه بواسطة إنزيم التقييد.

بمجرد تعديل قاعدة في تسلسل الحمض النووي بإضافة مجموعة ميثيل ، تفشل إنزيمات التقييد في التعرف على هذا الحمض النووي ولا يمكنها قطعه. هذه هي الطريقة التي تعدل بها البكتيريا وبالتالي تحمي الحمض النووي الصبغي الخاص بها من الانقسام بواسطة إنزيمات التقييد هذه.

كان أول نوكلياز للتقييد هو Hin d II (hin-dee-two). يعتمد عملها على تسلسل محدد للنيوكليوتيدات في الحمض النووي. تم عزله عن طريق Haemophilus influenza Rd. لقد وجد أن Hin d II يقطع دائمًا جزيئات الحمض النووي عند نقطة معينة من خلال التعرف على تسلسل محدد من ستة أزواج أساسية.

يُعرف هذا التسلسل الأساسي المحدد باسم تسلسل التعرف على Hin d II. ينتج نهايات حادة. إلى جانب Hin d II ، نعرف اليوم أكثر من 900 إنزيم مقيد تم عزله من أكثر من 230 سلالة من البكتيريا يتعرف كل منها على تسلسلات التعرف المختلفة.

(4) تسلسل النوكليوتيدات المتناوب:

يفحص نوكلياز التقييد طول تسلسل الحمض النووي. بمجرد أن يتعرف على تسلسل معين ، فإنه يرتبط بالحمض النووي ويقطع كل من خيوط اللولب المزدوج في نقاط محددة في عظام ظهر فوسفات السكر. يسمى التسلسل الخاص في الحمض النووي المعترف به بواسطة نوكلياز التقييد تسلسل النوكليوتيدات المتناوب.

يتعرف نوكلياز التقييد على التسلسلات المتناظرة في الحمض النووي ويقطعها. المتناظرة عبارة عن مجموعات من الحروف التي تشكل نفس الكلمات عند قراءتها في كلا الاتجاهين للأمام والخلف.

المتناظرات في الحمض النووي هي تسلسلات زوجية قاعدية تكون متماثلة عند القراءة للأمام (من اليسار إلى اليمين) أو للخلف (من اليمين إلى اليسار) من محور التماثل المركزي. على سبيل المثال ، تقرأ التسلسلات التالية نفس الشيء على الخيطين في اتجاه 5 & # 8217— & gt 3 & # 8242. هذا صحيح أيضًا عندما نقرأ في الاتجاه 3 & # 8217— & GT 5 & # 8242.

تقوم إنزيمات التقييد بقطع شريط الحمض النووي بعيدًا قليلاً عن مركز المواقع المتناظرة ولكن بين نفس القاعدتين للخيوط المتقابلة. هذا يترك قواعد مفردة غير متزاوجة في نهايات مقطوعة. These ends with unpaired bases are called sticky ends or cohesive ends (Fig 11.3). The latter are named so because they form hydrogen bonds with their complementary cut counter parts. The sticky ends facilitate the action of the enzyme DNA ligase.

Gel Electrophoresis (Separation and Iso­lation of DNA Fragments):

After the cutting of DNA by restriction enzymes, fragments of DNA are formed. Separation of DNA fragments according to their size or length is done by a technique called gel electrophoresis developed by A. Tiselius in 1937. Electrophoresis is a tech­nique of separation of molecules such as DNA, RNA or protein on the basis of their size, under the influence of an electrical field, so that they migrate in the direction of electrode bearing the opposite charge, viz., positively charged molecules move towards cathode (-ve electrode) and negatively charged mol­ecules travel towards anode (+ve elec­trode) through a medium/matrix.

Electrophoresis performed in a gel matrix, so that molecules of similar elec­tric charge can be separated on the basis of size, is called gel electrophoresis. Now a days the most commonly used matrix is agarose which is a polysac­charide extracted from sea weeds. DNA fragments separate according to size through the pores of agarose gel. Hence the smaller the fragment size the farther it moves. Agarose dissolves in hot water when this solution is cooled, double helices form and become arranged laterally and produce thick filaments. These filaments become cross- linked to form the gel (Fig. 11.5). Pore size depends on agarose concentration.

The separated DNA fragments can be seen only after staining the DNA with a compound known as ethidium bromide (EtBr) followed by exposure to UV radiation as bright orange coloured bands. The separated bands of DNA are cut out from the agarose gel and extracted from the gel piece. This process is called as elution (removal of adsorbent). These purified DNA fragments are used in constructing recombinant DNA by linking them with cloning vectors.

(ب) Cloning Vectors (Vehicle DNA or carrier of DNA):

The vectors are DNA molecules that can carry a foreign DNA segment and replicate inside the host cell. Vectors may be plasmids, a bacteriophages (viruses that attack bacteria), cosmids, Yeast artificial chromosomes (YACs), Bacterial artificial chromosomes (BACs) and viruses. There are also some shuttle vectors. Out of these vectors, the most commonly used cloning vectors are plasmids and viruses.

Plasmids were discovered by Willium Hays and Joshua Lederberg (1952). These are extra-chromosomal, self-replicating, usually circular, double-stranded DNA molecules, found naturally in many bacteria and also in some yeast. Although plasmids are usually not essential for normal cell growth and division, they often confer some traits on the host organism, for example, resistance to certain antibiotics or toxins that can be a selective advantage under certain conditions.

The plasmid molecules may be present as 1 or 2 copies or in multiple copies (500-700) inside the host organ­ism. These naturally occurring plasmids have been modified to serve as vectors in the laboratory. The most widely used, versatile, easily manipu­lated vector pBR 322 is an ideal plasmid vector.

pBR322 Vector (Fig. 11.7):

This was the first artificial cloning vector constructed in 1977 by Boliver and Rodriguez. It is widely used in gene cloning experiments.

p — denotes that it is a plasmid

BR — stands for Boliver and Rodriguez who constructed this plasmid

322 — is a number given to distin­guish this plasmid from others developed in the same laboratory. For example, there are plasmids pBR 325, pBR 327, pBR 328, pBR 345 etc.

Features that is required to facilitate cloning into a Vector:

(i) Origin of Replication (Ori):

Origin of replication (Ori) is a specific sequence of DNA bases which is responsible for initiating replication. A prokaryotic DNA has a single origin of replication while eukaryotic DNA may have more than one origin of replication.

(ii) Selectable Markers:

Some genes called “selectable markers” help in selecting those host cells which contain the vectors (trans-formants) and eliminating the non­-trans formants. Transformation is a process through which a piece of DNA is introduced in a host bacterium. Generally, the genes encoding resistance to antibiotics such as tetracy­cline, ampicillin, kanamycin or chloramphenicol etc. are useful selectable markers for E. coli. The common E. coli cells are not resistant against any of these antibiotics. Plasmid pBR 322 has two resistance genes — ampicillin resistance (amp R ) and tetracyclin resistance (tet R ) which are considered useful for selectable markers.

(iii) Cloning Sites (Recognition Sites):

Plasmid pBR 322 has a variety of unique rec­ognition sites for restriction endonucleases. Two unique sites, Pst I and Pvu I are located within the amp R gene and Bam HI, Sal I, etc. are within tet R gene (Fig 11.7). Some other unique restriction sites are Eco RI, Cla I, Hind III, Pvu II, rop codes for the proteins involved in the replication of the plasmid.

The presence of restriction sites within the markers tet R and аmр R permits an easy selection for cells transformed with the recombinant pBR322. Insertion of the DNA frag­ment into the plasmid using enzyme Pst I or Pvu I places the DNA insert within the gene amp R this makes аmр R non-functional. Bacterial cells containing such a recombinant pBR322 will be unable to grow in the presence of ampicillin, but will grow on tetracycline. Similarly, when restriction enzyme Bam HI or Sal I is used, the DNA insert is placed within the gene tet r making it non-functional. Bacterial cells possessing such a recombinant pBR322 will, therefore, grow on ampicillin but not on tetracycline.

Due to inactivation of antibiotics, selection of recombinants becomes burdensome pro­cess because it requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics. Thus, alternative selectable marker is developed to differentiate recombinants and non-recombi­nants on the basis of their ability to produce colour in the presence of a chromogenic substance. Now a recombinant DNA is inserted in the coding sequence of an enzyme β- galactosidase.

This casues inactivation of the enzyme which is called insertional inacti­vation. If the plasmid in the bacterium does not have an insert, the presence of a chromoge­nic substrate gives blue coloured colonies. Presence of insert results into insertional inacti­vation of the p-galactosidase and, therefore, the colonies do not produce any colour, these colonies are marked as recombinant colonies.

(iv) Vectors for Cloning Genes in Plants and Animals:

A soil-inhabiting plant bacte­rium, Agrobacteriun tumefaciens, a pathogen (disease causing agent) of several dicot plants is able to transfer a piece of DNA known as ‘T-DNA’. The T-DNA causes tumours. The tumours are called crown galls. Tumour formation is induced by Ti plasmid (Ti for tumour inducing).

As gene transfer occurs without human effort, the bacterium is called natural genetic engineer of plants. Similarly retroviruses (cause leukosis or sarcoma types of cancer) in animals including humans are able to change normal cells into cancerous cells.

The tumour including Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens have been modified into cloning vector which is not pathogenic to the plants, however, it is still able to use the procedure to deliver genes of our interest into various plants. Similarly retroviruses are used to carry desirable genes into animal cells. Thus once a gene or DNA fragment is joined to a suitable vector it is transferred into a bacterial plant or animal host where it undergoes multiplication.

(2) Bacteriophage Vectors:

Bacteriophages (are simply phages) are viruses that attack bacterial cells by injecting their DNA into these cells. The injected DNA is selectively rep­licated and expressed in the host bacterial cell resulting in a number of phages which burst out of the cell (lytic pathway) and reinfect neighbouring cells.

This ability to transfer DNA from the phage genome to specific bacterial hosts during the process of bacterial infection gave scientists the idea that specially designed phage vectors would be useful tools for gene cloning experiments. Several bacteriophages are being used as cloning vectors but most commonly used are lambda (X) phage and M13 phage.

(a) Lambda Phage Vector:

It has a double-stranded, linear DNA genome of 48, 502bp, in which the 12 bases at each end are unpaired but complementary. These ends are, therefore, sticky or cohesive and are referred to as the cos sites (cohesive end sites). These sites are important for packaging DNA into phage heads. The lambda genome remains linear in the phage head, but within E. coli cells the two cohesive ends join to form a circular molecule necessary for replication. These vectors allow cloning of dna fragments upto 23 Kb length (= Kilobase— is a unit designating the length of a nucleic acid sequence, e.g., 1 Kb = 1000 nucleotide long base sequence).

It is filamentous phage which infects E. coli having F-pili. Its genome is a single stranded, circular DNA of 6407 bp. Foreign DNA can be inserted into it without disrupting any of the essential genes. After the Ml 3 phage DNA enters the bacterial cell, it is converted to a double-stranded molecule known as the replicative form or RF, which replicates until there are 100 copies in the cell and single-stranded copies of the genome are produced and extruded from the cell as M13 particles.

The major advantages of developing vectors based on M13 are that its genome is less than 10Kb length. The RF can be purified and manipulated exactly like a plasmid. In addition, genes cloned in M13 based vectors can be obtained in the form of single-stranded DNA.

Why are bacteriophage vectors more advantageous than plasmid vectors?

(i) Bac­teriophage vectors can be used for large DNA fragments and

(ii) These can easily be detected at the time of cloning experiments.

(C) Competent Host (For Transformation with Recombinant DNA):

(أ) DNA Mediated Gene Transfer (Vector Mediated Gene Transfer):

Competent host is essential for transformation with recombinant DNA (Fig. 11.12). Transformation “a process by which a cell takes up naked DNA fragment from the environment, incorporates it into its own chromosomal DNA and finally expresses the trait controlled by the incoming DNA”. The tools described earlier in this chapter will result in the generation of recombinant DNA (rDNA) molecules in the laboratory. Finally, the propagation of these DNA molecules must occur inside a living system or a host.

Many kinds of host cells, including E. coli, yeast, animal and plant cells, are available for genetic engineering and the kind of host cell to be used mainly depends on the aim of the cloning experiment. For the expression of some eukaryotic proteins, eukaryotic cells may be the preferred hosts. Yeasts have been used extensively for functional expression of eukaryotic genes because they offer several advan­tages. Yeasts are the simplest eukaryotic organisms and like bacteria are single-celled, genetically well-characterized, easy to grow and manipulate.

They can be grown readily in both small culture vessels and large scale bioreactors. Plant and animal cells may also be used as hosts in gene manipulation experiments and for protein expression either in tissue culture or as cells in the whole organism to create genetically modified plants and animals. Since DNA is a hydrophilic molecule, it cannot pass through membranes, so the bacterial cells must be made capable to take up DNA.

This is done by treating them with a specific concentration of a divalent cation, such as Calcium which increases the efficiency with which DNA enters the bacterium through pores in its cell wall. Recombinant DNA (rDNA) can then be forced into such cells by incubating the cells with recombinant DNA on ice, followed by placing them briefly at 42°C (heat shock), and then putting them back on ice. This enables the bacteria to take up the recombinant DNA.

Transfer of DNA into eukaryotic cell is called transfection.

(ب) Direct or Vector less Gene Transfer:

It is the process of gene transfer into the host cell without using a vector. This is possible by the following four important methods.

In this method foreign DNA is directly injected into the nucleus of animal cell or plant cell by using micro needles or micro pipettes. It is used in oocytes, eggs and embryo. Alec Jeffreys (1993) of Human Genome Centre, Michigan University U.S.A has cured mice that inherited a neuromuscu­lar disease which is like muscular dystrophy of humans.

Electroporation is the formation of temporary pores in the plasma membrane of host cells by using lysozyme or calcium chloride. These pores are used for introduction of foreign DNA.

3. Chemical Mediated Gene Transfer:

In this method certain chemicals such as polyethylene glycol (PEG) help foreign DNA to enter the host cell.

4. Biolistic Method or Gene gun Method:

Biolistic is a means of introducing DNA into cells that involves bombardment of cells with high-velocity micro projectiles coated with DNA. In biolistic method tungsten or gold particles, coated with foreign DNA are born barded into target cells at a very high velocity. Although this method is suitable for plants yet this technique is also used to insert genes into animal that promote tissue repair into cells (particularly cancer of mouth) near wounds.

This method failed to make an impression in treat­ment of genetic disorder but made great impact in the field of vaccine development.

After being introduced briefly to the tools in re­combinant DNA let us describe the processes to create recombinant DNA.


Top Vectors Products for Your Lab

PGEM®-T Easy Vector Systems

PCR cloning vectors with 3 options for insert excision.

PCMVT n T™ and pT n T™ Vectors

Convenient expression of cloned genes in vitro or in vivo. pCMVT n T™ Vector contains a CMV enhancer/promoter region, which enables strong constitutive expression in many cell types, while RNA phage promoters enable RNA synthesis in vitro.

Cytokine Signaling Pathway Analysis Firefly Luciferase Vectors

Four vectors containing response elements (ISRE, SIE, SBE or STAT5RE) that are used to explore cytokine signaling pathways.


CRISPR endonucleases, or Cas proteins, cut nucleic acids based on the guide RNA sequence. Cas proteins come in many forms and have been adapted for different functions such as cutting DNA or RNA. Read these blog posts to learn about different Cas proteins.

Guide RNAs (gRNAs) are short synthetic RNA sequences that are composed of a scaffold sequence for Cas binding and a user-defined

20 nucleotide region that defines the genomic target to be modified. Changing the target sequence in the gRNA allows you to change the genomic target of the Cas protein. Learn more about how you can design and modify gRNAs.


PCR النسخ العكسي (RT-PCR)

RT-PCR, or reverse transcriptase PCR, is a variation of the standard PCR technique that involves the amplification of specific mRNA obtained from very small samples. It eliminates the need for the tedious mRNA purification process required for conventional cloning techniques. With RT-PCR, reverse transcriptase and an RNA sample are used in addition to the standard PCR reagents. The reaction mixture is heated to 37 ˚C, which allows for the production of complementary cDNA copy from the RNA sample by reverse transcriptase. This cDNA then anneals to one of the primers leading to first strand synthesis. Standard PCR follows from here in which dsDNA is ultimately generated. RT-PCR is frequently combined with real time PCR (qPCR), which is widely used for the quantification of transcript levels in cells and tissues.


& ltp> يعرض هذا القسم افتراضيًا تسلسل البروتين الأساسي وعند الطلب جميع الأشكال الإسوية الموضحة في الإدخال. يتضمن أيضًا معلومات ذات صلة بالتسلسل (التسلسلات) ، بما في ذلك & lta href = "http://www.uniprot.org/help/sequence٪5Flength"> length & lt / a> و & lta href = "http: //www.uniprot .org / مساعدة / التسلسلات "> الوزن الجزيئي & lt / a>. يتم تقديم المعلومات في أقسام فرعية مختلفة. الأقسام الفرعية الحالية ومحتواها مذكورة أدناه: & ltp> & lta href = '/ help / Sequences_section' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> التسلسل s (2+) i

& ltp> هذا القسم الفرعي من & lta href = "http://www.uniprot.org/help/sequences٪5Fsection"> Sequence & lt / a> يشير إلى ما إذا كان & lta href = "http://www.uniprot.org/help / canonical٪ 5Fand٪ 5Fisoforms "> التسلسل الأساسي & lt / a> المعروض افتراضيًا في الإدخال مكتمل أم لا. & ltp> & lta href = '/ help / sequence_status' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> حالة التسلسل i: مكتمل.

<p>This subsection of the <a href="http://www.uniprot.org/help/sequences%5Fsection">Sequence</a> section indicates if the <a href="http://www.uniprot.org/help/canonical%5Fand%5Fisoforms">canonical sequence</a> displayed by default in the entry is in its mature form or if it represents the precursor.<p><a href='/help/sequence_processing' target='_top'>More. </a></p> Sequence processing i : The displayed sequence is further processed into a mature form.

يصف هذا الإدخال 2 & ltp> يسرد هذا القسم الفرعي من قسم "التسلسل" متواليات البروتين البديلة (الأشكال الإسوية) التي يمكن إنشاؤها من نفس الجين بواسطة واحد أو عن طريق الجمع بين ما يصل إلى أربعة أحداث بيولوجية (استخدام محفز بديل ، وربط بديل ، وبدء بديل و تغيير الإطارات الريبوسومية). بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا القسم معلومات ذات صلة عن كل شكل إسوي بروتيني بديل. & ltp> & lta href = '/ help / altern_products' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> الأشكال الإسوية التي أنتجتها الربط البديل . المحاذاةإضافة إلى السلة تمت الإضافة إلى السلة

This entry has 2 described isoforms and 1 potential isoform that is computationally mapped.Show allAlign All

تم اختيار هذا الشكل الإسوي باعتباره & ltdiv> & ltp> & ltb> ما هو التسلسل الكنسي؟ & lt / b> & ltp> & lta href = '/ help / canonical_and_isoforms' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> التسلسل الأساسي المتعارف عليه. تشير جميع المعلومات الموضعية في هذا الإدخال إليها. هذا هو أيضًا التسلسل الذي يظهر في الإصدارات القابلة للتنزيل من الإدخال.

يختلف تسلسل هذا الشكل الإسوي عن التسلسل الكنسي على النحو التالي:
1-232: Missing.

<p>In eukaryotic reference proteomes, unreviewed entries that are likely to belong to the same gene are computationally mapped, based on gene identifiers from Ensembl, EnsemblGenomes and model organism databases.<p><a href='/help/gene_centric_isoform_mapping' target='_top'>More. </a></p> Computationally mapped potential isoform sequences i

Annotation score:2 out of 5

Experimental Info

مفتاح الميزةالمنصب (ق)وصف الإجراءات عرض رسوميطول
<p>This subsection of the 'Sequence' section reports difference(s) between the canonical sequence (displayed by default in the entry) and the different sequence submissions merged in the entry. These various submissions may originate from different sequencing projects, different types of experiments, or different biological samples. Sequence conflicts are usually of unknown origin.<p><a href='/help/conflict' target='_top'>More. </a></p> Sequence conflict i 79K → R in AAD44483 (Ref. 1) Curated 1
Sequence conflict i 150D → G in BAG52108 (PubMed:14702039). Curated 1
Sequence conflict i 272 – 274EEL → RDF in AAD44483 (Ref. 1) Curated 3
Sequence conflict i 421K → R in BAG59111 (PubMed:14702039). Curated 1

<p>This subsection of the 'Sequence' section provides information on polymorphic variants. If the variant is associated with a disease state, the description of the latter can be found in the <a href="http://www.uniprot.org/manual/involvement%5Fin%5Fdisease">'Involvement in disease'</a> subsection.<p><a href='/help/polymorphism' target='_top'>More. </a></p> Polymorphism i

Natural variant

مفتاح الميزةالمنصب (ق)وصف الإجراءات عرض رسوميطول
<p>This subsection of the 'Sequence' section describes natural variant(s) of the protein sequence.<p><a href='/help/variant' target='_top'>More. </a></p> Natural variant i VAR_013827 125S → N. Corresponds to variant dbSNP:rs2305710 Ensembl . 1
Natural variant i VAR_067273 167V → A 1 Publication

Manual assertion based on experiment in i

Alternative sequence

مفتاح الميزةالمنصب (ق)وصف الإجراءات عرض رسوميطول
<p>This subsection of the 'Sequence' section describes the sequence of naturally occurring alternative protein isoform(s). The changes in the amino acid sequence may be due to alternative splicing, alternative promoter usage, alternative initiation, or ribosomal frameshifting.<p><a href='/help/var_seq' target='_top'>More. </a></p> Alternative sequence i VSP_042876 1 – 232Missing in isoform 2. 1 Publication

<p>Manually curated information that is based on statements in scientific articles for which there is no experimental support.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000303">More. </a></p> Manual assertion based on opinion in i


شاهد الفيديو: كيفية العثور على كود تتبع UA بدلا من G كيفية الحصول على معرف Universal Analytics google (أغسطس 2022).