معلومة

الثالوث التحفيزي لسيرين بروتياز

الثالوث التحفيزي لسيرين بروتياز



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يعتبر السيرين حمضًا في الثالوث الحفاز المشارك في آلية عمل سيرين بروتياز؟ إنه التبرع ببروتون له ولكني لست متأكدًا مما إذا كان هذا مؤهلًا حقًا للحمض؟


يعتمد ذلك على كيفية تعريفك للحمض. لما يستحق ، فإن التعريف الكيميائي الذي يقدمه Google عندما أبحث هو "جزيء أو أنواع أخرى يمكنها التبرع ببروتون أو قبول زوج إلكترون في التفاعلات". على هذا الأساس بقايا السيرين في الثالوث الحفاز يكون بمثابة حمض مؤين ضعيف.

بالطبع في المحلول المائي ، لا تعتبر مجموعة هيدروكسيل السيرين الحرة حمضية ، ولكن إحدى السمات المهمة لتحفيز الإنزيم هي أن بقايا الأحماض الأمينية تعمل في بيئة مختلفة يمكن أن تعزز نشاطها. أحد العوامل هو القرب من المخلفات الأخرى. آخر هو أن ثابت العزل الكهربائي الفعال يمكن أن يكون مختلفًا في الجزء الداخلي المقاوم للماء للبروتين والذي يمكن أن يستبعد جزيئات الماء.


تشريح الثالوث التحفيزي لسيرين بروتياز

توجد بروتينات السيرين في جميع الكائنات الحية تقريبًا وتعمل داخل الخلية وخارجها على حد سواء ، فهي موجودة كعائلتين ، `` تشبه التربسين '' و `` تشبه السبيتيزين '' ، والتي طورت بشكل مستقل جهازًا تحفيزيًا مشابهًا يتميز بـ Ser ، His ، ثالوث Asp ، موقع ارتباط بالأكسجين ، وربما محددات أخرى تعمل على استقرار حالة الانتقال (الشكل 1). بالنسبة إلى Bacillus amyloliquefaciens subtilisin ، تنقل هذه العناصر الوظيفية تعزيزًا إجماليًا للمعدل لا يقل عن 10 (9) إلى 10 (10) أضعاف التحلل المائي غير الإنزيمي لروابط الأميد. لقد قمنا بفحص الأهمية التحفيزية والتفاعل بين المخلفات داخل الثالوث الحفاز عن طريق الاستبدال الفردي أو المتعدد بألانين (ألانين) ، باستخدام الطفرات الموجهة للموقع لجين B. amyloliquefaciens subtilisin المستنسخ. تم اختيار بدائل الألانين لتقليل التلامس الفراغي غير المواتي ولتجنب فرض تفاعلات شحنة جديدة أو روابط هيدروجينية من السلاسل الجانبية المستبدلة. على النقيض من تأثير الطفرات في البقايا المتضمنة في ارتباط الركيزة ، فإن الطفرات في الثالوث الحفاز تقلل بشكل كبير من رقم الدوران وتسبب تأثيرات طفيفة فقط على ثابت ميكايليس. تُظهر التحليلات الحركية للطفرات المتعددة أن البقايا داخل الثالوث تتفاعل بشكل تآزري لتسريع التحلل المائي لرابطة الأميد بعامل يبلغ حوالي 2 × 10 (6).


يعتبر الثالوث التحفيزي للبروتياز الخاص بالخصيتين (TSP50) ضروريًا لوظيفته في تكاثر الخلايا

البروتياز 50 الخاص بالخصيتين (TSP50) هو جين مؤيد للأورام تم تحديده حديثًا ويشترك في بنية إنزيمية مماثلة مع العديد من بروتياز السيرين. أشارت نتائجنا السابقة إلى أن TSP50 يمكن أن يعزز تكوين الأورام من خلال تحلل بروتين IκBα وتفعيل إشارات NF-B ، ويمكن أن تؤدي طفرة الثريونين في ثالوثها الحفزي إلى تثبيط تكاثر الخلايا بوساطة TSP50. ومع ذلك ، ما إذا كانت البقايا الأخرى في الثالوث التحفيزي لـ TSP50 تلعب دورًا في الحفاظ على نشاط الأنزيم البروتيني وتكوين الأورام ، ولا تزال الآليات المشاركة في هذه العملية غير واضحة. هنا ، قمنا ببناء وتمييز ثلاثة متحولات ثلاثية محفزة لـ TSP50 ووجدنا أن جميع المسوخات يمكن أن تثبط بشكل كبير تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرات الناجم عن TSP50 في المختبر والورم في الجسم الحي ، ولعب حمض الأسبارتيك في الموضع 206 في الثالوث الحفاز أكثر أهمية من الثريونين والهيستيدين في هذه العملية. كشفت الدراسات الميكانيكية أن الطفرات في الثالوث الحفاز ألغت نشاط إنزيم TSP50 ، لكنها لم تغير التوطين الخلوي. علاوة على ذلك ، أشارت بياناتنا إلى أن جميع المسوخات الثلاثة قد أوقفت تنشيط إشارة NF-B عن طريق منع التفاعل بين TSP50 ومعقد NF-κB: IκBα. الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أن TSP50 يمكن أن يتفاعل مع بروتين IκBα ويقطعه مباشرة كبروتياز جديد في المختبر.

الكلمات الدالة: ثالوث الحفاز آلية تكاثر الخلايا المسوخ سيرين بروتياز TSP50.


الثالوث التحفيزي لبروتياز سيرين - علم الأحياء

سيرين بروتياز ومثبطات سيرين بروتياز

مايكل ج. بيج وإنريكو دي سيرا ، قسم الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة واشنطن ، سانت لويس ، ميسوري

سيرين بروتياز هي من بين أكبر مجموعة من الإنزيمات المحللة للبروتين في الجينوم البشري والتي تلعب أدوارًا حيوية في الصحة والمرض. يتم تنظيم نشاطهم في الجسم الحي بواسطة مجموعة متنوعة من مثبطات الأنزيم البروتيني السيرين. يتم تقديم لمحة عامة عن التفاعل بين سيرين بروتياز ومثبطاتهم. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة مناهج توصيف هذه العلاقة مع التركيز لاحقًا على كيفية تطبيق هذه التدابير على الأمراض التي تنتج عن خلل في سيرين بروتياز أو مثبطاتهم.

يتم التوسط في الحياة الخلوية من خلال نشاط البروتينات ، وبالتالي فإن التحكم في تركيزها وحالتها أمر حيوي. إن الإنزيمات التي تحلل روابط الببتيد ، البروتياز ، هي مكونات أساسية للجينوم. قد يعمل البروتياز كعوامل غير محددة للهضم أو وسطاء انتقائية عالية لتعديل ما بعد الترجمة. البروتياز هي مجموعة متنوعة من الإنزيمات. تم تحديد أكثر من 180 عائلة متميزة نسبيًا من البروتياز بواسطة نظام تصنيف البروتياز MEROPS على أساس أضعاف البروتين بالإضافة إلى فصلها من خلال علاقة النشوء والتطور (1). من بين هذه العائلات ، تضم المجموعة الأكبر سيرين بروتياز ، والتي تم تسميتها بناءً على تطبيقها لمجموعة الهيدروكسيل لسلسلة جانبية سيرين على أنها نيوكليوفيل محفز. يتم التوسط في تنظيم وظيفة البروتياز في الجسم الحي من خلال 90 عائلة على الأقل من مثبطات الأنزيم البروتيني. تتحكم هاتان المجموعتان معًا في الوظائف البيولوجية داخل وخارج الخلية. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي العيوب الجينية في البروتياز أو المثبط إلى أمراض خطيرة مع تأثر مسارات بيولوجية متعددة محتملة.

سيرين بروتياز ومثبطاتهم

أكثر من ثلث الإنزيمات المحللة للبروتين هي سيرين بروتياز (2). ينبع اسم العائلة من بقايا السيرين النووية داخل الموقع النشط ، والتي تهاجم جزء الكربونيل لرابطة الببتيد الركيزة لتشكيل إنزيم أسيل وسيط. المحبة النووية للسيرين الحفزي تعتمد بشكل شائع على ثالوث محفز من حمض الأسبارتيك ، الهيستيدين والسيرين - يشار إليه عادة بنظام ترحيل الشحنة (3). لوحظ لأول مرة بواسطة Blow منذ أكثر من 30 عامًا في بنية كيموتربسين (4) ، تم العثور على نفس التركيبة في أربعة طيات بروتينية ثلاثية الأبعاد أخرى تحفز التحلل المائي للروابط الببتيدية. وقد لوحظت أمثلة على هذه الطيات في التربسين ، والسبتيليزين ، والبروليل أوليجوبيبتيداز ، والبروتياز ClpP. تستخدم العديد من عائلات الإنزيمات الأخرى نفس الثالوث التحفيزي ، مثل الأسباراجيناز ، والإستيراز ، والأسيلاز ، وبيتا لاكتامازات (5). يؤثر التحلل المائي لحمض الأسبارتيك إلى الألانين على التحلل المائي لرابطة الببتيد بدرجة أكبر من التحلل المائي للإستر ، مما يشير إلى أن ثالوث تحفيزي كامل مطلوب من أجل التحلل المائي لرابطة الببتيد الأقوى. وتجدر الإشارة إلى أن العديد من عائلات سيرين بروتياز تستخدم آلية ثنائية يتم فيها إقران ليسين أو هيستيدين مع سيرين الحفاز. ومع ذلك ، فإن بروتياز سيرين الأخرى تقدم ثلاثيات تحفيزية جديدة ، مثل زوج من الهيستيدينات جنبًا إلى جنب مع سيرين nucleophilic. في جميع الحالات المبلغ عنها تقريبًا ، يمكن جعل سيرين الموقع النشط غير نشط بواسطة مثبطات عامة مثل ثنائي أيزوبروبيل فلورو فوسفات وفلوريد فينيل ميثان سلفونيل. سوف نركز على أكثر عائلات مثبطات سيرين بروتياز وسيرين بروتياز وفرة في الجينوم البشري. تتم إحالة القارئ أيضًا في جميع أنحاء النص إلى مراجعات أخرى حديثة وأكثر توسعية وإلى قاعدة بيانات MEROPS للحصول على وصف أكثر تفصيلاً للتنوع المثير للإعجاب لبروتياز السيرين وبنية المثبط ووظيفتها ونشاطها.

يحتوي الجينوم النموذجي على 2-4٪ من الجينات التي تشفر الإنزيمات المحللة للبروتين. يشار إلى كامل تكملة الببتيداز داخل الجينوم بالتحلل (6). من بين هذه البروتياز ، خضعت مجموعة فرعية منتقاة من الببتيدات لتكرار جيني كبير وتباعد. إن ببتيدات سيرين الشبيهة بالتريبسين (عائلة Clan PA Family S1 Subfamily A في تسمية MEROPS) هي أكبر مجموعة من الببتيدات المتجانسة في الجينوم البشري المسؤولة عن مختلف العمليات البيولوجية الحرجة. لوحظت تركيبة متحللة مماثلة في جميع الفقاريات ، مما يشير إلى أن توسع عائلة ببتيداز S1A حدث قبل ظهور السلالة منذ ما يقرب من 450 مليون سنة. من بين 699 ببتيداز في البشر ، 178 منها عبارة عن ببتيداز سيرين ، و 138 منها تنتمي إلى عائلة ببتيداز S1. تقدم الطية الشبيهة بالكيموتريبسين لعائلة الببتيداز S1 منصة تحفيزية مثالية تتيح معدل دوران مرتفع وانتقائية ركيزة وأنماط مختلفة من التنظيم في حزمة مدمجة بسهولة مع مجالات بروتين إضافية (7).

عشيرة PA: SI peptidases - التربسين

البروتياز الكيموتربسين هو أكبر عائلة معروفة من الببتيدات. استخدمت الدراسات الرائدة إنزيمات الجهاز الهضمي مثل التربسين وكيموتريبسين ، والتي تشق سلاسل بولي ببتيد على الجانب C الطرفي من سلسلة جانبية موجبة الشحنة (أرجينين أو ليسين) أو بقايا كبيرة كارهة للماء (فينيل ألانين ، التربتوفان ، أو التيروزين) ، على التوالي. في تسميات Schechter & amp Berger ، تقع رابطة الببتيد المتحللة مائيًا بين بقايا P1 و P1 من الركيزة ويتم ترقيمها بشكل متزايد باتجاه كلا الاتجاهين N و C. يحدث التفاعل في الموقع الفرعي المرقّم بشكل مشابه (S) في البروتياز. على سبيل المثال ، يربط الجيب S2 بقايا P2 ، وهو ثاني حمض أميني على الجانب N-terminal من الرابطة الانشطارية. كشف تحديد متواليات عديد الببتيد الأخرى للعديد من بروتياز السيرين عن عائلة كبيرة من الإنزيمات. تنتمي التربسين والكيموتريبسين إلى عائلة S1A من عشيرة PA ، بينما تضم ​​عائلة S1B بروتياز بكتيرية مختلفة ومجموعة HtrA الفرعية من البروتياز المسؤولة عن دوران البروتين داخل الخلايا (8). تشترك كلتا العائلتين الفرعيتين في بنية ثنائية البرميل. يشتمل براميل P-key اليونانيان على طية الكيموتريبسين وهما متماثلان بطريقة غير تقليدية (الشكل 1 أ). تكشف طوبولوجيا β-strand للثنية عن بنية المفتاح اليوناني في كلا البراملين ، إلا أن هذه الهيكلية تنشأ من تسلسلات تعمل في الاتجاه المعاكس. ومن ثم ، فإن نصفي الهيكل عبارة عن صور معكوسة في مساحة طية البروتين. كلا البراملين مقسمان وظيفيًا بنهاية تشارك في التحفيز والثانية في التنظيم. الموقع النشط يقع في الشق بينهما.

يتوسط الثالوث الحفاز التقليدي في عائلة الببتيدات S1 التحلل المائي لرابطة الببتيد (الشكل 1 ب). تسهل الرابطة الهيدروجينية بين البقايا Asp-102 و His-57 (يتم استخدام ترقيم الكيموتريبسين) استخلاص البروتون من Ser-195 ويخلق محبي نيوكليوفيل قوي. يتم تحقيق استقرار الثالوث الحفاز من خلال شبكة من الروابط الهيدروجينية الإضافية التي يتم توفيرها من خلال العديد من بقايا الأحماض الأمينية المحفوظة للغاية والتي تحيط بالثالوث ، وخاصة Thr-54 و Ala-56 و Ser-214 ، ومدعومة بشكل أكبر برابطة ثاني كبريتيد بين المخلفات 42 و 58. يستمر التفاعل عبر وسيطة زوجية رباعية السطوح. في الخطوة الأولى ، ينتج عن الهجوم المحب للنيوكليوفيلي بواسطة السيرين وسيط أوكسانيون مستقر بواسطة أميدات العمود الفقري لـ Gly-193 و Ser-195. يؤدي انهيار الوسيط رباعي السطوح إلى توليد إنزيم أسيل وسيط ، ويتم توسط تثبيت الطرف N الذي تم إنشاؤه حديثًا بواسطة His-57. قدم هارتلي وكيلبي دليلاً على وسيط إنزيم الأسيل في عام 1954 (9). في هذه التجارب الأولية ، حددت دفعة حالة ما قبل الاستقرار للمنتج بشكل صحيح أن ارتباطًا بشق هيدروكسيل داخل كيموتربسين كان متورطًا في آلية التفاعل. النصف الثاني من الآلية هو انعكاس للخطوة الأولى ، حيث يقوم جزيء الماء بإزاحة جزء متعدد الببتيد الحر ويهاجم أنزيم الأسيل الوسيط. مرة أخرى ، تعمل فتحة الأكسجة على استقرار الوسيط رباعي السطوح الثاني ، ويؤدي انهيار هذا الوسيط إلى تحرير طرف C جديد في الركيزة. يعتبر تنشيط الزيموجين عنصراً أساسياً في تنظيم نشاط الببتيداز.

الشكل 1. (أ) بنية ثنائية البرميل لعائلة الببتيداز S1A (PDB 1OS8). بعد التنشيط ، يقوم ذراع الزيموجين بتثبيت شق الموقع النشط الذي يقع بين البراملين. يوجد حلزون α إضافي عند الطرف C. (ب) يتم إنشاء الثالوث الحفاز الكنسي عن طريق الترتيب المكاني لـ Asp-102 و His-57 و Ser-195 الموضوعة لتسهيل تكوين الرابطة الهيدروجينية واستخراج بروتون جزء الهيدروكسيل.

يتطلب تنشيط معظم ببتيدات السيرين الشبيهة بالكيموتريبسين معالجة بروتينية لبروتين سلائف زيموجين غير نشط. يحدث انقسام سلائف البروتين في موضع مماثل في جميع أفراد الأسرة المعروفين: بين المخلفات 15 و 16. ويؤدي الطرف N الناشئ إلى تغيير تكوين في الإنزيم من خلال تكوين تفاعل إلكتروستاتيكي داخل الجزيء مع Asp-194 الذي يعمل على استقرار كل من الأكسجة موقع ربط الثقب والركيزة (10). يوفر تنشيط Zymogen آلية تنظيم قوية تمنح التحكم الزمني في نشاط الأنزيم البروتيني ، والقدرة على الهروب من تثبيط الإنزيم المبكر ، ويضع هذه الإنزيمات في سياق سلاسل الأحداث المحللة للبروتين. يتم تنظيم العديد من بروتياز مسارات التخثر والمناعة بشكل أكبر من خلال آليات التباين التي تتضمن الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na +) ، الكاتيونات ثنائية التكافؤ (Ca 2+) ، الجليكوزامينوجليكان ، والعوامل المساعدة البروتينية (11). هذه الخصائص مستمدة من بنية طية كيموتربسين وتتحد لإنتاج شبكات تحلل البروتين المسؤولة عن العمليات البيولوجية الرئيسية المسؤولة عن صحة الإنسان.

تعتمد العديد من العمليات الحيوية على ببتيدازات عشيرة PA. من أهمها تخثر الدم والاستجابة المناعية ، والتي تنطوي على شلالات من تنشيط الزيموجين المتسلسل. في كلا النظامين ، يتم دمج مجال ببتيداز طيات الكيموتريبسين مع مجالات بروتين أخرى مرتبطة بها ، بما في ذلك مجالات عامل التفاح و CUB و EGF و fibronectin و kringle و sushi و von Willebrand. توجد مجالات البروتين هذه على الطرف N كامتداد لقطاع البروببتيد من الببتيداز. مثل هذا الاتجاه للنطاقات المرتبطة بـ N-terminal في عائلة الببتيداز S1A شائع في جميع أشكال الحياة. تقترن بنية المجال جيدًا مع آلية تنشيط zymogen ، والتي تحرر الطرف N المناسب لتمكين النشاط التحفيزي. في كثير من الأحيان ، تظل مجالات البروتين المرتبطة مرتبطة بمجال الببتيداز من خلال رابطة ثاني كبريتيد تساهمية على السطح المقابل للموقع النشط للبروتياز. يتم ترميز العديد من المجالات المرتبطة بالكامل بواسطة exon واحد في جين الببتيداز الخاص بهم ويقترح دورًا مهمًا لخلط exon أثناء التطور الجزيئي لعشيرة PA.

يتم تجميع ببتيدات S1 في الجينوم البشري ، في معظمها ، نسبيًا في ست فئات وظيفية: الهضم والتخثر والمناعة والتريبتاز والماتريبتاز والكاليكرين والجرانزيمات. تشارك إنزيمات مختلفة في تكسير البروتينات في الجهاز الهضمي. التربسين ، الكيموتريبسين ، والإيلاستازات هي ببتيدات داخلية تحلل البولي ببتيدات إلى سلاسل أقصر. يتم التوسط في المزيد من الهضم بواسطة exopeptidases المختلفة (12). على وجه الخصوص ، فإن carboxypeptidases A و B من عائلة M14 من البروتياز المعتمد على الزنك تقصر الببتيدات الناشئة من خلال الانتقائية التكميلية تجاه المخلفات الأساسية أو العطرية. يشير الإطلاق غير المناسب للتربسين من الجهاز الهضمي إلى استجابات مسببة للالتهابات تتوسطها عادةً ببتيدات S1 الشبيهة بالتريبتاز. إن التريبتازات هي مكونات رئيسية في الحبيبات الإفرازية للخلايا البدينة الفريدة من نوعها بين الببتيدات من عشيرة PA بسبب تركيبها الرباعي المتماثل (13). مثل التربسين ، تتوسط التربتاز الإشارات المسببة للالتهاب من خلال مستقبلات تنشط بالبروتياز 2 ، ومع ذلك فإن تعريف الركائز الأخرى في الحالات الصحية والمرضية لا يزال بعيد المنال. إن Matriptases عبارة عن ببتيدات S1 مرتبطة بالغشاء والتي تحمل انتقائية ركيزة أولية تشبه التربسين (14). مرة أخرى ، الركائز الفسيولوجية لهذه الفصيلة الفرعية من الببتيدات غير معروفة إلى حد كبير ، ومع ذلك ترتبط مستويات التعبير الجيني العالية لماتريبتاس بأنواع مختلفة من السرطان. أدى ارتباط مماثل بالسرطان إلى اهتمام كبير بالعائلة الكبيرة من kallikreins (15) ، وهي عائلة معروفة عمومًا بدورها في تنظيم ضغط الدم من خلال نظام kinin (16). الجرانزيمات هي وسطاء للاستماتة الموجهة عن طريق الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية السامة للخلايا والتي تلعب أدوارًا رئيسية في الدفاع ضد العدوى الفيروسية (17). والجدير بالذكر أن الفريد بين عشيرة PA هو الانتقائية الأولية للجرانزيمات تجاه المخلفات الحمضية في موضع P1 من الركائز. من بين مجموعة متنوعة من البروتياز في عائلة PA S1 ، تمت دراسة وسطاء المناعة وتجلط الدم جيدًا بشكل خاص.

عشيرة SC: تنوع الببتيداز في α / أضعاف

ببتيدات SC Clan هي إنزيمات طية هيدروليز / p تتكون من خيوط β متوازية تحيط بها حلزونات α. توفر a / p hydrolase-fold منصة تحفيزية متعددة الاستخدامات والتي ، بالإضافة إلى تحقيق نشاط التحلل البروتيني ، يمكن أن تعمل إما كإستريز ، أو ليباز ، أو ديهالوجيناز ، أو هالوبيروكسيداز ، أو لياز ، أو إيبوكسيد هيدرولاز (18). تعرف ست عائلات متميزة نسبيًا من عشيرة SC ، وأربعة منها فقط لديها هيكل معروف. قد تكون القابلية التحفيزية لثنية هيدروليز α / هي السبب وراء كون ببتيدازات SC العشيرة ثاني أكبر عائلة من ببتيدات السيرين في الجينوم البشري. لا تحتاج الفئات الميكانيكية الأخرى إلى استخدام السيرين الحفاز وبدلاً من ذلك استخدام حمض السيستين أو الجلوتاميك (19). تقدم clan SC peptidases هندسة متطابقة للثالوث التحفيزي الذي لوحظ في العشائر PA و SB ، ومع ذلك يتم ترتيب هذه الكوكبة بشكل مختلف في تسلسل متعدد الببتيد. تتطور انتقائية الركيزة من الحلزونات التي تحيط بنواة الصفيحة المركزية. داخل العشيرة SC ، تعتبر carboxypeptidases من العائلة S10 فريدة من نوعها لقدرتها على الحفاظ على النشاط التحفيزي في البيئات الحمضية. تقريبًا جميع ببتيدات السيرين لها نشاط مقيد في نطاق الأس الهيدروجيني المحايد إلى القلوي. تحلل العديد من ركائز ببتيدازات SC في العشيرة على الجانب الطرفي C لبقايا البرولين مع استثناءات عديدة. تحدث كل من الأنشطة المحللة للبروتينات والمحللة الخارجية للبروتين في العشيرة SC ، والتي تتناقض مع الاتجاه في عائلات سيرين ببتيداز الأخرى التي يكون فيها الأعضاء في الغالب واحدًا أو آخر. للحصول على أمثلة على الانتقائية المختلفة في العشيرة SC ، يقوم البرولايل أوليجوبيبتيداز من الأسرة S9 بفصل روابط الببتيد داخل الببتيدات ، ويزيل البرولايل أمينوببتيداز من الأسرة S33 بقايا البرولين والهيدروكسي برولين N-terminal من الببتيدات (20). يتم اشتقاق انتقائية الركيزة للببتيدات التي يقل طولها عن 30 من الأحماض الأمينية من بنية المجالين. يقيد المروحة ذات السبعة شفرات N-terminal الوصول إلى مجال C-terminal α / hydrolase ، وبالتالي موقع التحلل المائي لرابطة الببتيد (21). على أساس انتقائيتها تجاه الببتيدات الأصغر وليس البروتينات كاملة الطول ، يُعتقد أن ببتيدات SC العشائرية مهمة بشكل خاص في آليات إرسال الإشارات الخلوية.

في البشر ، غالبًا ما ترتبط ببتيدات SC في العشيرة بمعالجة N-terminal الخاصة بالبرولين للببتيدات والبروتينات ، ومع ذلك فإن العديد منها يقدم وظيفة غير حال للبروتين. S9 هي أكبر عائلة من ببتيدات SC للعشيرة مع 41 متماثلًا في الجينوم البشري. من بين هؤلاء المتماثلات ، يعتبر البرولايل أوليجوبيبتيداز (POP) و dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) هو الأفضل تميزًا. كشف التركيب البلوري لـ POP عن بنية المجالين وأساس انتقائية الركيزة. والجدير بالذكر أنه لم يتم العثور على مثبط طبيعي لهذه العائلة من البروتياز. تم اقتراح دور مفترض للملوثات العضوية الثابتة في استقلاب الببتيدات العصبية المختلفة (22). يقدم DPP-IV بنية مماثلة ذات مجالين (23). DPP-IV هو بروتين عبر الغشاء مسؤول عن معالجة الهرمونات والكيموكينات. تم تحديد ثلاثة فقط من عائلة ببتيداز S10 في الجينوم البشري ، ولا يزال يتعين الكشف عن أدوارها البيولوجية. من بين ثلاثة ببتيدات من عائلة S28 في البشر ، يتميز فقط ثنائي ببتيدل ببتيداز الثاني (DPP-II). يحفز DPP-II إطلاق اثنين من الأحماض الأمينية الطرفية N عندما يكون البرولين أو الألانين في وضع P1. توجد ثمانية عشر ببتيداز من عائلة S33 في الجينوم البشري ، ومع ذلك ، لا يُظهر الكثير منها نشاط الببتيداز. على سبيل المثال ، تحفز العديد من هذه الإنزيمات التحلل المائي لروابط الإيبوكسيد إلى ديول وتلعب دورًا في إزالة السموم أو الإشارات الخلوية (24).

عشيرة SB: عائلة S8 - subtilisins

تنتشر الببتيدات من عشيرة SB في الجينومات النباتية والبكتيرية مع عدد قليل من الممثلين في جينوم حيواني معين. ومع ذلك ، فإن هذه المحولات البروتينية ضرورية لمعالجة البروتين في جميع الميتازوا. النموذج الأصلي للعشيرة SB هو subtilisin. تم اكتشاف Subtilisin في الأصل في البكتيريا موجبة الجرام Bacillus subtilis ومثل الكيموتريبسين كان أحد أقدم الهياكل البلورية للبروتينات التي تم تحديدها (25). تم العثور على الثالوث التحفيزي لحمض الأسبارتيك والهيستيدين والسيرين في التنظيم الهندسي الدقيق الذي لوحظ في الببتيدات في العشائر PA و SC ، ومع ذلك فإن طية البروتين المحيطة لا تحمل أي تشابه (الشكل 2). تحتوي Clan SB أيضًا على عائلة ثانية من peptidases S53 ، sedolisins. في هذه الببتيدات ، يتم استبدال قاعدة الهيستيدين العامة بحمض الجلوتاميك ، ويتم تثبيت رباعي السطوح الوسيط بواسطة مجموعة كربوكسيل سالبة الشحنة من حمض الأسبارتيك بدلاً من الشحنات الموجبة الجزئية. أثبتت السوبتيليزين أنها مفيدة للغاية لدراسات هندسة البروتين. تشمل الأمثلة الناجحة لهندسة سقالة السبيتيزين انتقائية الركيزة ، والاستقرار الحراري ، والتكيف مع البرودة ، والاستقرار في المذيبات غير المائية ، وتفعيل الفلورايد ، والقدرة على العمل كببتيد ليجاز (26). أدت العديد من الدراسات الهندسية التي أجريت على مادة سبتيليزين إلى تحسين عوامل التنظيف بشكل كبير لاستخدامها في منظفات الغسيل. تميل الوظيفة الفسيولوجية لعشيرة SB peptidases إلى أن تكون موجهة نحو التغذية مع أدوار محددة في معالجة البروتين. تفضل معظم ببتيدات SB العشيرة تحلل الركائز على الجانب C الطرفي للمخلفات الكبيرة الكارهة للماء. ومع ذلك ، فإن معالجة البروتينات الببتيدازات مثل kexin و furin تنشق بعد زوج من المخلفات ثنائية القاعدة (27). تُفرز معظم ببتيدات SB خارج الخلية أو مترجمة إلى غشاء الخلية. استثناء ملحوظ هو tripeptidyl-peptidases المسؤولة عن دوران البروتين داخل الخلايا.

الشكل 2. يقدم Subtilisin (PDB 1SCN) ثالوثًا تحفيزيًا متطابقًا لتلك التي لوحظت في إنزيمات وإنزيمات السيرين الأخرى ولكن داخل طية بروتين مختلفة تمامًا.

داخل الجينوم البشري ، تم تحديد 10 ببتيدات من عشيرة SB تسعة تنتمي إلى عائلة S8 ، وواحد فقط من عائلة S53. على الرغم من أنها معروفة جيدًا بدورها في معالجة البروتينات على طول مسار الإفراز ، إلا أن أدوارًا جديدة لتحويلات البروتينات البروبروتينية آخذة في الظهور ، بما في ذلك تنظيم مستويات بروتين البلازما. Tripeptidyl-peptidase I (TPP-I) هو الممثل الوحيد من عائلة S53 في الجينوم البشري وواحد من العديد من الببتيدات الليزوزومية المسؤولة عن دوران البروتين (28). يزيل TPP-I ثلاثة أحماض أمينية من الطرف N للببتيدات الصغيرة. ترتبط الطفرات في TPP-I بالتضخم الشحمي العصبوني الطفلي (مرض باتن) ، وهو الاضطراب التنكسي العصبي الأكثر شيوعًا عند الأطفال ، والذي يتميز بتراكم الخلايا الدهنية الذاتية التألق.

تم تصنيف أكثر من 90 عائلة متميزة نسبيًا من مثبطات الأنزيم البروتيني بواسطة قاعدة بيانات MEROPS. سنركز المناقشة الحالية على المجموعات الأكثر وفرة وتميزًا.

الآلية المتعارف عليها: مثبطات من نوع kunitz و kazal

بشكل عام ، تتفاعل مثبطات الأنزيم البروتيني مع الببتيداز بطريقة تشبه الركيزة الكنسية مع البروتياز. في هذه الحالة ، تتفاعل ثلاثة إلى أربعة وحدات بنائية بطريقة ورقة مضادة للتوازي داخل موقع الإنزيم النشط. العديد من مثبطات الأنزيم البروتيني هذه عبارة عن بروتينات صغيرة يبلغ طولها عادةً 30 إلى 120 حمض أميني (29). غالبًا ما تحتوي مثبطات البروتياز الأصغر هذه على العديد من روابط ثاني كبريتيد. العديد من البروتياز لديها درجات حرارة انصهار عالية للغاية (> 80 درجة مئوية) وتحتفظ بتشكلها الأصلي في وجود تشوتروبوس قوي. على الرغم من عدم تجانس التسلسل ، فإن كل من هذه المثبطات تقدم شكلاً متطابقًا تقريبًا في حلقة الموقع التفاعلي التي تقيد نشاط التحلل. في هذه العملية ، لا تخضع حلقة الموقع التفاعلي لتغيير توافقي عندما تكون معقدة مع البروتياز ويتم وضع بقايا P1 لوضع الكربون الكاربوني على مسافة قصيرة جدًا إلى Ser-195. يشير الأكسجين الكربوني ، بدوره ، نحو ثقب الأكسجين الذي يشكل روابط H مع مجموعتي الأميد في Gly-193 و Ser-195. يتم توجيه نيتروجين الأميد من بقايا P1 نحو Oy of Ser-195 الذي لا يواجه Ser-214 كما هو مذكور عادةً في الركائز الطبيعية. يُعتقد أن التغيير الأخير يقصر أثناء عملية الانقسام الحفاز (30). يمكن دمج الحلقة مع العناصر الهيكلية الأخرى للتوسط في التثبيط ، بما في ذلك دبوس الشعر P الذي يتبع الحلقة أو رابطة ثاني كبريتيد على مقربة من الرابطة المقصية. أثناء التفاعل مع البروتياز ، تظل الرابطة المقصية سليمة وقد تخضع لتشوه طفيف من الاستواء أو مركب ميكايليس أكثر تشوهًا اعتمادًا على اقتران الإنزيم والمثبط. يحدد عدد قليل من جهات الاتصال المحددة التفاعل بين البروتياز والمثبط خارج الموقع النشط ، حيث يكون معظمهم كارهًا للماء. في المقابل ، يساهم تكوين حلقة الموقع التفاعلي في الطاقة الأكثر أهمية في عملية الربط. لذلك ، يمكن استخدام تغيير بقايا P1 عن طريق الطفرات لتحويل ملف التثبيط بشكل كبير. يضمن عدم وجود جهات اتصال إضافية أن معظم مثبطات سيرين بروتياز تنظم نشاط العديد من البروتياز في الجسم الحي.

تحدد MEROPS مثبطات من نوع Kunitz كعائلات I2 و I3 ، ومع ذلك يبدو أنها تطورت بشكل منفصل في التاريخ التطوري. يشار إلى العائلات I2 و I3 باسم "Kunitz-A" و "Kunitz-P" نظرًا لأصلهما من الحيوانات والنباتات ، على التوالي. كان أبروتينين ، المعروف أيضًا باسم مثبط التربسين البقري للبنكرياس ، أحد أول مثبطات الأنزيم البروتيني التي تم تحديدها وعزلها بواسطة كراوت وزملائه في عام 1930. تعد عائلة I2 أكثر تجانسًا إلى حد كبير ويعتقد أنها تمنع فقط ببتيداز S1. على النقيض من ذلك ، تنقسم عائلة I3 إلى مجموعتين من النشوء والتطور ، I3A و I3B ، وكلاهما يمنع عادةً ببتيداز S1 ، ومع ذلك يمكن لأفراد عائلة I3A أيضًا تثبيط عائلة A1 الأسبارتيل البروتياز وعائلة C1 البروتياز. كان الهيكل الأول لمثبط I3 هو مركب مثبط التربسين بفول الصويا مع التربسين بواسطة Sweet وزملائه (31). يقدم الهيكل بنية على شكل برميل متوجًا بزوج من خيوط المستقرة بواسطة سندات ثنائي كبريتيد (الشكل 3). لا تزال الوظيفة الفسيولوجية للبروتياز من نوع كونيتز غير معروفة للعديد من أفراد الأسرة بخلاف الرجال. تم اقتراح الوقاية ضد الهضم أو الغزو من مسببات الأمراض بناءً على الوفرة الشائعة في البذور. في الإنسان ، مثبط مسار العامل النسيجي هو مثبط رئيسي من نوع كونيتز مسؤول عن تنظيم تكوين الجلطة الدموية. على أساس قوتها ، كانت مثبطات نوع كونيتز من بين أول ما تم فحصه للتطبيق العلاجي. تمت الموافقة على أبروتينين للتطبيق السريري في جراحة الكسب غير المشروع لتجاوز الشريان التاجي في عام 1993. بعد خمسة عشر عامًا ، نشأ جدل كبير حول استخدامه نظرًا لخطر الوفاة المصاحب وتوافر نظائر اللايسين الأقل تكلفة والتي تحقق نفس الأهداف (32).

الشكل 3. التكوين المعقد بين التربسين ومثبط التربسين فول الصويا يمثل آلية مثبطات نوع كونيتز (PDB 1AVW). تؤدي معدلات التحلل المائي لسندات الببتيد المخفّضة إلى تثبيط.

تصنف مثبطات Kazal على أنها عائلة I1 بواسطة قاعدة بيانات MEROPS. الاسم مشتق من مثبط إفراز البنكرياس ، والذي يطلق عليه الآن SPINK1 ، تم عزله في الأصل من قبل Kazal وزملاء العمل في عام 1948. تلعب عائلة SPINK (مثبط الأنزيم البروتيني السيرين ، Kazal) أدوارًا مهمة في الجهاز الهضمي ، والرئتين ، والجلد ، وعلى الأرجح العديد من الآخرين. أنسجة في الجسم. يمكن التعرف على ستة سبينكس في الجينوم البشري ، وكل منها يحتوي على تكرارات متعددة لطيَّة كازال. ترتبط الطفرات في SPINK1 بالتهاب البنكرياس الوراثي (33). متلازمة Netherton هي اضطراب نادر يؤثر على جلد المرضى وينتج عنه جلدي سماوي وتشوهات في عمود الشعر. تم العثور على المرضى الذين يعانون من متلازمة Netherton لديهم طفرة في الكروموسوم 5 في جين SPINK5 ، والذي يشفر مجموعة من 15 مجال مثبط من نوع Kazal (34). تم إجراء توصيف كيميائي حيوي كبير على مثبطات البويضة المخاطية لعائلة Kazal (35). والجدير بالذكر أنه نظرًا لوجود مجالات متعددة من نوع Kazal غالبًا داخل سلسلة بولي ببتيد واحدة ، فإنها لا تحتاج إلى تثبيط نفس النوع من خصائص البروتياز أو البروتياز. على سبيل المثال ، يحتوي Dog bikazin على مجالين من نوع Kazal حيث يفضل أحدهما التربسين والآخر يفضل كيموتريبسين.

آلية الطعم والمصيدة: السربينات

تم العثور على السربينات في جميع ممالك الحياة ، ومع ذلك فإن وجودها في كائن حي معين ليس كذلك ، مما يشير إلى أن العائلة قد خضعت لعملية نقل جيني وفقدان كبير. صاغ كاريل وترافيس اسم العائلة كاختصار لمثبط سيرين بروتياز (36). السربينات هي الشكل الأكثر وفرة لمثبطات إنزيم بروتياز السيرين في الجينوم البشري. باستثناء الفطريات ، يبدو أن جميع حقيقيات النوى متعددة الخلايا تمتلك واحدًا أو أكثر من جينات السربين. ومع ذلك ، على الرغم من انتشارها في كل مكان ، فإن القليل من الوظائف الفسيولوجية تُنسب إلى السربينات بخلاف تلك المعروفة لدى الإنسان ، وعلى وجه الخصوص ، فهي مرتبطة بالأمراض. معظم السربينات هي مثبطات لا رجعة فيها لسيرين بروتياز من عائلة S1 من الببتيدازات مع أفراد عائلة مختارين يثبطون S9 من subtilisins وبروتياز السيستين. فقد العديد من أفراد عائلة السربين قدرتهم على العمل كمثبطات واكتسبوا وظائف جديدة مثل الألبومين البيضاوي والعامل المشتق من الظهارة الصبغية. تلقت الآلية الفريدة لتثبيط الأنزيم البروتيني بواسطة السربينات اهتمامًا كبيرًا.

تتكون السربينات من قلب محفوظ من ثلاث أوراق وثمانية أو تسعة حلزونات a تعمل بشكل جماعي في آلية التثبيط. كما هو الحال مع مثبطات Kazal- و Kunitz ، تتضمن الآلية حلقة مكشوفة على السطح تسمى حلقة المركز التفاعلية (RCL). يقدم RCL امتدادًا قصيرًا من تسلسل متعدد الببتيد يحمل الرابطة الانشطارية P1-P1. مثل عائلات مثبطات الأنزيم البروتيني السيرين ، تهيمن بقايا P1 على الديناميكا الحرارية التي تحكم التفاعل بين البروتياز والمثبط. عادةً ما يتم التوسط في تعرض بقايا P1 للمذيب بواسطة 15 حمضًا أمينيًا N- طرفًا إلى بقايا P1 و 5 بقايا على الجانب "الرئيسي" للطرف C من الرابطة المقصية. Evidence for dramatic conformational change in the inhibitory mechanism was first provided by the crystal structure of the cleaved form of α1-antitrypsin (37). In this structure and unlike the native form, the reactive center loop was not solvent exposed but occurred as an additional β-strand within the core of the structure.

Dramatic conformational change of both inhibitor and protease is the most recognizable feature of the serpin mechanism (Fig. 4). After formation of the Michaelis-Menten encounter complex, the reactive center loop is cleaved, and an acyl enzyme intermediate is formed as in the normal serine protease catalytic mechanism. However, after bond hydrolysis, the RCL rapidly inserts into the central P-sheet of the serpin, which yields an overall stability enhancement to the inhibitor and traps the acyl-enzyme intermediate. It largely unknown how this change in conformation occurs. Several studies suggest the complex undergoes transient exchange between expelled and partially inserted states (38). Integration of the β-strand into the structure flips the protease from the “top” of the structure to the complete opposite side of the serpin. Because of this, the local environment of the catalytic triad is distorted and therefore cannot complete the catalytic cycle (39). When the process is finished, the previously adjacent P1 and P1’ residues are separated by over 70 A. During this process, the protease has been converted from a metastable free state into a more energetically favored relaxed bound state. Serpins have a considerably lower melting temperature (Tم

60 °C) in isolation than when cleaved (Tم > 100 °C). Unrelated in sequence or structure, the macroglobulin family of protease inhibitors similarly applies scissile bond cleavage, yet the subsequent step involves entrapment of the protease in a cage-like architecture (40). Although most serpins apply this mechanism to inhibit serine proteases irreversibly, a select group has been shown to act reversibly. For example, protein C inhibitor, also known as PAI-1, acts as a reversible inhibitor to the single-chain urokinase-type plasminogen activator. Moreover, several serpins are known to integrate their cleaved RCL into another serpin molecule in trans (41). In turn, serpins can undergo polymerization, which becomes relevant in several pathological conditions.

Figure 4. A large conformational change defines the mechanism of serpin inhibition. Conversion of the Michaelis complex (PDB 1OPH) into cleaved trapped conformation (PDB 1 EZX) traps the RCL of serpin into the p-strand core of inhibitor. A significant gain in stability, therefore, is imparted to the entire serpin structure.

Serpins play key regulatory functions in man. α1-antitrypsin serves a major role in protecting the connective tissue of the lungs from leukocyte-released elastase. The C1 inhibitor restricts proteases of the immune system from unwanted proteolysis and inflammation. Two plasminogen activator inhibitors control fibrinolysis. Viral serpins have also been described that broker their survival and propagation through restricting these same proteolytic pathways. Control of blood clot formation is through antithrombin. However, unlike other serpin family members, the interaction between clotting factor protease and antithrombin is greatly facilitated by heparin or heparin sulfate glycosaminoglycans, which bind to the inhibitor to mediate this effect (42). In turn, antithrombin is directed toward regulation of protease activity at cell surfaces such as the vascular endothelium, which display heparin in various forms.

Exosite recognition: hirudin and other anticoagulant molecules

Numerous strategies have evolved in different pathogenic and parasitic organisms to alter the coagulation cascade for their own benefit. Snake and leech venoms have yielded a plethora of serine proteases and serine protease inhibitors that bear this trait. Many inhibitors function through hijacking the macromolecular recognition regions in blood clotting factors, the earliest known example of which is hirudin, a 66-amino acid residue protein that is an extremely tight binding and selective inhibitor of the blood coagulation protease thrombin. Indeed, the use of leeches in medicine dates back to the Greeks in 200 B.C. However, it was not until 1884 that Haycraft isolated the anticoagulant agent from medicinal leech saliva and termed this agent hirudin. Selective and tight binding results from the cooperative binding at both the anion binding exosite responsible for fibrinogen recognition and active site of thrombin. Notably, unlike nearly all other protease inhibitors, active site recognition involves formation of a parallel β-sheet. Hirudin has been derivatized and modified in various ways to develop direct thrombin inhibitors. Two recombinant forms, lepirudin and desirudin, are available for clinical use to prevent deep-vein thrombosis after surgery and treat heparin-induced thrombocytopenia. However, various problems have limited their use, including bleeding problems, short half-life, and development of antihirudin antibodies. Additional modification of the hirudin platform and other medicinal chemistry strategies aimed at thrombin inhibition is well described in Reference 43.

Characterization of Protease-Inhibitor Interactions

Defining the selectivity and potency of an inhibitor relies on accurate characterization of the protease. In particular, values of kقط and kقط/Kم are readily obtained using basic enzymology and various commercially available chromogenic and fluorogenic substrates. Proteases act on a single substrate during the catalytic cycle. Therefore, models to interpret data follow classical descriptions of competitive, noncompetitive, and mixed inhibition. As with traditional enzymology, curve-fitting measures combined with graphical validation of data is suggested as a more accurate approach than the use of initial rates analysis. Use of IC50 is to be avoided as the values of this measure are only a crude comparison between reversible inhibitors. For serine proteases, the use of irreversible inhibitors, such as chloromethyl ketones, are extremely useful for determining the amount of active protease in a given protein preparation. Many serine protease inhibitors form stable complexes with their target proteases that can be resolved via gel electrophoresis as a simple and effective means of visualization. However, many protease-inhibitor interactions require more advanced data treatment. Some examples include slow tight-binding mechanisms and higher-order stoichiometries of inhibition (44). Lastly, conformational change can be measured through various biophysical techniques including UV and fluorescence spectroscopy, circular dichroism, and isothermal titration calorimetry.

Serine Proteases and their Inhibitors in Disease

As illustrated above, the human genome encodes a large and diverse population of serine proteases and serine protease inhibitors. Design of small-molecule inhibitors to restrict proteolytic activity continues to garner attention in the pharmaceutical industry. Given the many related proteases in the genome, this task is particularly challenging. Early work focused on active site-directed therapies. However, as evidenced by the naturally occurring serine protease inhibitors, active site recognition enables the regulation of multiple protease targets. Minimization of unwanted side effects is then a significant hurdle. More recent effort has sought the development of therapeutics that focus on other regions of the protease. The crucial role for such regions in biological systems is demonstrated by the blood coagulation and immune system proteases, in which macromolecular recognition is dependent on exosites and the allosteric communication of these regions with the active site.

Diversity of proteases and inhibitors results in a wide range of pathologies that result from disruption in either serine protease or serine protease inhibitor. The earliest descriptions of such imbalances are within the blood coagulation cascade. For example, hemophilia B results from deficiency in coagulation factor IX. In contrast, excessive activation of immune system serine proteases produces inflammatory states. Errors in serine protease inhibitors can have consequences on multiple biological systems. However, overlapping inhibition by multiple families of inhibitor can, in certain instances, lessen the severity of the pathology. Genetic abnormalities in the serpins have also been associated with polymerization and therefore belong to the category of conformational disease. Emphysema, cirrhosis, and thrombosis may result from such aberrant conformational transitions. Neuroserpin may also play a key role in familial encephalopathy because of the formation of inclusion body-like material (45). Understanding the molecular mechanisms of limited proteolysis and their regulation in vivo remains a challenging and insightful venue to improve human health.

1. Rawlings ND, Morton FR, Kok CY, Kong J, Barrett AJ. MEROPS: the peptidase database. الدقة الأحماض النووية. 2008 36:D320-325.

2. Page MJ, Di Cera E. Serine peptidases: classification, structure and function. زنزانة. مول. Life Sci. In press.

3. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity. تشيم. Rev. 2002 102:4501-4524.

4. Blow DM, Birktoft JJ, Hartley BS. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin. Nature 1969 221:337-340.

5. Dodson G, Wlodawer A. Catalytic triads and their relatives. اتجاهات Biochem. علوم. 1998 23:347-352.

6. Lopez-Otin C, Overall CM. Protease degradomics: a new challenge for proteomics. نات. Rev. Mol. Cell Biol. 2002 3:509-519.

7. Page MJ, Macgillivray RT, Di Cera E. Determinants of specificity in coagulation proteases. J. Thromb. Haemost. 2005: 32401-2408.

8. Pallen MJ, Wren BW. The HtrA family of serine proteases. مول. ميكروبيول. 1997 26:209-221.

9. Hartley BS, Kilby BA. The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin. Biochem. J. 1954 56:288-297.

10. Bode W, Fehlhammer H, Huber R. Crystal structure of bovine trypsinogen at 1-8 A resolution. I. Data collection, application of Patterson search techniques and preliminary structural interpretation. J. Mol. بيول. 1976: 106:325-335.

11. Page MJ, Di Cera E. Role of Na + and K + in enzyme function. فيسيول. Rev. 2006 86:1049-1092.

12. Whitcomb DC, Lowe ME. Human pancreatic digestive enzymes. Dig Dis. علوم. 2007 52:1-17.

13. Pereira PJ, Bergner A, Macedo-Ribeiro S, Huber R, Matschiner G, Fritz H, Sommerhoff CP, Bode W. Human beta-tryptase is a ring-like tetramer with active sites facing a central pore. Nature 1998 392:306-311.

14. Lin CY, Anders J, Johnson M, Sang QA, Dickson RB. Molecular cloning of cDNA for matriptase, a matrix-degrading serine protease with trypsin-like activity. J. بيول. تشيم. 1999 274: 18231-18236.

15. Diamandis EP, Yousef GM, Luo LY, Magklara A, Obiezu CV The new human kallikrein gene family: implications in carcinogenesis. Trends Endocrinol. Metab. 2000 11:54-60.

16. Proud D, Kaplan AP Kinin formation: mechanisms and role in inflammatory disorders. Annu. Rev. Immunol. 1988 6:49-83.

17. Barry M, Bleackley RC. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. نات. Rev. Immunol. 2002 2:401-409.

18. Nardini M, Dijkstra BW. Alpha/beta hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 1999 9:732-737.

19. Hotelier T, Renault L, Cousin X, Negre V, Marchot P, Chatonnet A. ESTHER, the database of the alpha/beta-hydrolase fold superfamily of proteins. الدقة الأحماض النووية. 2004 32:D145-147.

20. Rea D, Fulop V. Structure-function properties of prolyl oligopeptidase family enzymes. Cell Biochem. بيوفيز. 2006 44:349-365.

21. Kuhn B, Hennig M, Mattei P. Molecular recognition of ligands in dipeptidyl peptidase IV. بالعملة. Top Med. تشيم. 2007 7:609-619.

22. Garcia-Horsman JA, Mannisto PT, Venalainen JI. On the role of prolyl oligopeptidase in health and disease. Neuropeptides 2007 41:1-24.

23. Rasmussen HB, Branner S, Wiberg FC, Wagtmann N. Crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV/CD26 in complex with a substrate analog. نات. هيكل. بيول. 2003 10:19-25.

24. Arand M, Cronin A, Adamska M, Oesch F. Epoxide hydrolases: structure, function, mechanism, and assay. طرق الانزيم. 2005 400:569-588.

25. Wright CS, Alden RA, Kraut J. Structure of subtilisin BPN’ at 2.5 angstrom resolution. Nature 1969 221:235-242.

26. Bryan PN. Protein engineering of subtilisin. بيوكيم. بيوفيز. Acta 2000 1543:203-222.

27. Hosaka M, Nagahama M, Kim WS, Watanabe T, Hatsuzawa K, Ikemizu, J, Murakami K, Nakayama K. Arg-X-Lys/Arg-Arg motif as a signal for precursor cleavage catalyzed by furin within the constitutive secretory pathway. J. بيول. تشيم. 1991 266:12127-12130.

28. Turk B, Turk D, Turk V. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers. بيوكيم. بيوفيز. Acta. 2000 1477:98-111.

29. Bode W, Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. يورو. J. Biochem. 1992 204:433-451.

30. James MN, Sielecki AR, Brayer GD, Delbaere LT, Bauer CA. Structures of product and inhibitor complexes of Streptomyces griseus protease A at 1.8 A resolution. A model for serine protease catalysis. J. Mol. بيول. 1980 144:43-88.

31. Sweet RM, Wright HT, Janin J, Chothia CH, Blow DM. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6-A resolution. Biochemistry 1974 13:4212-4228.

32. Sedrakyan A, Treasure T, Elefteriades JA. Effect of aprotinin on clinical outcomes in coronary artery bypass graft surgery: a systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004 128:442-448.

33. Witt H, Luck W, Hennies HC, Classen M, Kage A, Lass U, Landt O, Becker M. Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. نات. Genet. 2000 25:213-216.

34. Chavanas S, Bodemer C, Rochat A, Hamel-Teillac D, Ali M, Irvine AD, Bonafe JL, Wilkinson J, Taieb A, Barrandon Y, Harper JI, de Prost Y, Hovnanian A. Mutations in SPINK5, encoding a serine protease inhibitor, cause Netherton syndrome. نات. Genet. 2000 25:141-142.

35. Laskowski M Jr, Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Annu. Rev. Biochem. 1980 49:593-626.

36. Travis J, Owen M, George P, Carrell R, Rosenberg S, Hallewell RA, Barr PJ. Isolation and properties of recombinant DNA produced variants of human alpha 1-proteinase inhibitor. J. بيول. تشيم. 1985 260:4384-4389.

37. Loebermann H, Tokuoka R, Deisenhofer J, Huber R. Human alpha 1-proteinase inhibitor. Crystal structure analysis of two crystal modifications, molecular model and preliminary analysis of the implications for function. J. Mol. بيول. 1984 177:531-557.

38. Whisstock JC, Bottomley SP. Molecular gymnastics: serpin structure, folding and misfolding. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 2006 16:761-768.

39. Huntington JA, Read RJ, Carrell RW. Structure of a serpin protease complex shows inhibition by deformation. Nature 2000 407:923-926.

40. Sottrup-Jensen L. Alpha-macroglobulins: structure, shape, and mechanism of proteinase complex formation. J. بيول. تشيم. 1989 264:11539-11542.

41. Zhou A, Carrell RW. Dimers initiate and propagate serine protease inhibitor polymerisation. J. Mol. بيول. 2008 37536-42.

42. Bourin MC, Lindahl U. Glycosaminoglycans and the regulation of blood coagulation. Biochem. J. 1993 289(Pt 2):313-330.

43. Schwienhorst A. Direct thrombin inhibitors - a survey of recent developments. زنزانة. مول. حياة. علوم. 2006 63:2773-2791.

44. Schechter NM, Plotnick MI. Measurement of the kinetic parameters mediating protease-serpin inhibition. Methods 2004 32:159-168.

45. Davis RL, Shrimpton AE, Holohan PD, Bradshaw C, Feiglin D, Collins GH, Sonderegger P, Kinter J, Becker LM, Lacbawan F, Krasnewich D, Muenke M, Lawrence DA, Yerby MS, Shaw CM, Gooptu B, Elliott PR, Finch JT, Carrell RW, Lomas DA. Familial dementia caused by polymerization of mutant neuroserpin. Nature 1999 401:376-379.


Substrate binding

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket (Figure 4.54). The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are bulky and hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior.

Figure 4.54 - 2. Binding of substrate to S1 pocket in the active site


9.1.3. Serine is Part of a Catalytic Triad That Also Includes Histidine and Aspartic Acid

Structural Insights, Chymotrypsin: A Serine Protease

Work with interactive molecular models to learn more about the structural bases of active site specificity and reactivity, and some of the ways in which active site residues can be identified.

The determination of the three-dimensional structure of chymotrypsin by David Blow in 1967 was a source of further insight into its mechanism of action. Overall, chymotrypsin is roughly spherical and comprises three polypeptide chains, linked by disulfide bonds. It is synthesized as a single polypeptide, termed chymotrypsinogen, which is activated by the proteolytic cleavage of the polypeptide to yield the three chains. The active site of chymotrypsin, marked by serine 195, lies in a cleft on the surface of the enzyme (Figure 9.6). The structural analysis revealed the chemical basis of the special reactivity of serine 195 (Figure 9.7). The side chain of serine 195 is hydrogen bonded to the imidazole ring of histidine 57. The -NH group of this imidazole ring is, in turn, hydrogen bonded to the carboxylate group of aspartate 102. This constellation of residues is referred to as the catalytic triad. How does this arrangement of residues lead to the high reactivity of serine 195? The histidine residue serves to position the serine side chain and to polarize its hydroxyl group. In doing so, the residue acts as a general base catalyst, a hydrogen ion acceptor, because the polarized hydroxyl group of the serine residue is poised for deprotonation. The withdrawal of the proton from the hydroxyl group generates an alkoxide ion, which is a much more powerful nucleophile than an alcohol is. The aspartate residue helps orient the histidine residue and make it a better proton acceptor through electrostatic effects.

Figure 9.6

Three-Dimensional Structure of Chymotrypsin. The three chains are shown in ribbon form in orange, blue, and green. The side chains of the catalytic triad residues, including serine 195, are shown as ball-and-stick representations, as are two intrastrand (more. )

Figure 9.7

The Catalytic Triad. The catalytic triad, shown on the left, converts serine 195 into a potent nucleophile, as illustrated on the right.

These observations suggest a mechanism for peptide hydrolysis (Figure 9.8). After substrate binding (step 1), the reaction begins with the hydroxyl group of serine 195 making a nucleophilic attack on the carbonyl carbon atom of the substrate (step 2). The nucleophilic attack changes the geometry around this carbon atom from trigonal planar to tetrahedral. The inherently unstable tetrahedral intermediate formed bears a formal negative charge on the oxygen atom derived from the carbonyl group. This charge is stabilized by interactions with NH groups from the protein in a site termed the oxyanion hole (Figure 9.9). These interactions also help stabilize the transition state that precedes the formation of the tetrahedral intermediate. This tetrahedral intermediate then collapses to generate the acyl-enzyme (step 3). This step is facilitated by the transfer of a proton from the positively charged histidine residue to the amino group formed by cleavage of the peptide bond. The amine component is now free to depart from the enzyme (step 4) and is replaced by a water molecule (step 5). The ester group of the acyl-enzyme is now hydrolyzed by a process that is essentially a repeat of steps 2 through 4. The water molecule attacks the carbonyl group while a proton is concomitantly removed by the histidine residue, which now acts as a general acid catalyst, forming a tetrahedral intermediate (step 6). This structure breaks down to form the carboxylic acid product (step 7). Finally, the release of the carboxylic acid product (step 8) readies the enzyme for another round of catalysis.

Figure 9.8

Peptide Hydrolysis by Chymotrypsin. The mechanism of peptide hydrolysis illustrates the principles of covalent and acid-base catalysis. The dashed green lines indicate favorable interactions between the negatively charged aspartate residue and the positively (more. )

Figure 9.9

The Oxyanion Hole. The structure stabilizes the tetrahedral intermediate of the chymotrypsin reaction. Hydrogen bonds (shown in green) link peptide NH groups and the negatively charged oxygen.

This mechanism accounts for all characteristics of chymotrypsin action except the observed preference for cleaving the peptide bonds just past residues with large, hydrophobic side chains. Examination of the threedimensional structure of chymotrypsin with substrate analogs and enzyme inhibitors revealed the presence of a deep, relatively hydrophobic pocket, called the S1 pocket, into which the long, uncharged side chains of residues such as phenylalanine and tryptophan can fit. The binding of an appropriate side chain into this pocket positions the adjacent peptide bond into the active site for cleavage (Figure 9.10). The specificity of chymotrypsin depends almost entirely on which amino acid is directly on the amino-terminal side of the peptide bond to be cleaved. Other proteases have more-complex specificity patterns, as illustrated in Figure 9.11. Such enzymes have additional pockets on their surfaces for the recognition of other residues in the substrate. Residues on the amino-terminal side of the scissile bond (the bond to be cleaved) are labeled P1, P2, P3, and so forth, indicating their positions in relation to the scissile bond. Likewise, residues on the carboxyl side of the scissile bond are labeled P1′, P2′, P3′, and so forth. The corresponding sites on the enzyme are referred to as S1، س2 or S1′, S2′, and so forth.

Figure 9.10

The Hydrophobic Pocket of Chymotrypsin. The hydrophobic pocket of chymotrypsin is responsible for its substrate specificity. The key amino acids that constitute the binding site are labeled, including the active-site serine residue (boxed). The position (more. )

Figure 9.11

Specificity Nomenclature for Protease-Substrate Interactions. The potential sites of interaction of the substrate with the enzyme are designated P (shown in red), and corresponding binding sites on the enzyme are designated S. The scissile bond (also (more. )


An alternate geometry for the catalytic triad of serine proteases

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: In lieu of an abstract, this is the article's first page.


Chymotrypsin

Consider the mechanism of catalysis of the enzyme known as chymotrypsin. Found in our digestive system, chymotrypsin&rsquos catalytic action is cleaving peptide bonds in proteins and it uses the side chain of a serine in its mechanism of catalysis. Many other protein- cutting enzymes employ a very similar mechanism and they are known collectively as serine proteases. It acts fairly specifically, cutting not all peptide bonds, but only those that are adjacent to specific amino acids in the protein. One of the amino acids it cuts adjacent to is phenylalanine. The enzyme&rsquos action occurs in two phases &ndash a fast phase that occurs first and a slower phase that follows. The enzyme has a substrate binding site that includes a region of the enzyme known as the S1 pocket. Let us step through the mechanism by which chymotrypsin cuts adjacent to phenylalanine.

Figure 6.1.1: mechanism of catalysis of the enzyme chymotrypsin.

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket. The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior. When the proper substrate binds, it stays and its presence induces an ever so slight shift in the shape of the enzyme. This subtle shape change on the binding of the proper substrate starts the steps of the catalysis and is the reason that the enzyme shows specificity for cutting at specific enzyme positions in the target protein. Only amino acids with the side chains that interact well with the S1 pocket start the catalytic wheels turning.

The slight changes in shape of the enzyme upon binding of the proper substrate cause changes in the positioning of three amino acids (aspartic acid, histidine, and serine) in the active site known as the catalytic triad, during the second step of the catalytic action. The shift of the negatively charged aspartic acid towards the electron rich histidine ring favors the abstraction of a proton by the histidine from the hydroxyl group on the side chain of serine, resulting in production of a very reactive alkoxide ion in the active site. Since the active site at this point also contains the polypeptide chain positioned with the phenylalanine side chain embedded in the S1 pocket, the alkoxide ion performs a nucleophilic attack on the peptide bond on the carboxyl side of phenylalanine sitting in the active site. This reaction, which is the third step of catalysis, breaks the bond and causes two things to happen. First, one end of the original polypeptide is freed and exits the active site. The second is that the end containing the phenylalanine is covalently linked to the oxygen of the serine side chain. At this point we have completed the first (fast) phase of the catalysis.

The second phase of the catalysis by chymotrypsin is slower. It requires that the covalent bond between phenylalanine and serine&rsquos oxygen be broken so the peptide can be released and the enzyme can return to its original state. The process starts with entry of water into the active site. Water is attacked in a fashion similar to that of the serine side chain in the first phase, creating a reactive hydroxyl group that performs a nucleophilic attack on the phenylalanine-serine bond, releasing it and replacing the proton on serine. The second peptide is released in the process and the reaction is complete with the enzyme back in its original state.


4.7: Chymotrypsin

  • Contributed by Kevin Ahern & Indira Rajagopal
  • Professor (Biochemistry and Biophysics) at Oregon State University

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket. The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior. When the proper substrate binds, it stays and its presence induces an ever so slight shift in the shape of the enzyme. This subtle shape change on the binding of the proper substrate starts the steps of the catalysis and is the reason that the enzyme shows specificity for cutting at specific enzyme positions in the target protein. Only amino acids with the side chains that interact well with the S1 pocket start the catalytic wheels turning.

The slight changes in shape of the enzyme upon binding of the proper substrate cause changes in the positioning of three amino acids (aspartic acid, histidine, and serine) in the active site known as the catalytic triad, during the second step of the catalytic action. The shift of the negatively charged aspartic acid towards the electron rich histidine ring favors the abstraction of a proton by the histidine from the hydroxyl group on the side chain of serine, resulting in production of a very reactive alkoxide ion in the active site. Since the active site at this point also contains the polypeptide chain positioned with the phenylalanine side chain embedded in the S1 pocket, the alkoxide ion performs a nucleophilic attack on the peptide bond on the carboxyl side of phenylalanine sitting in the active site. This reaction, which is the third step of catalysis, breaks the bond and causes two things to happen. First, one end of the original polypeptide is freed and exits the active site. The second is that the end containing the phenylalanine is covalently linked to the oxygen of the serine side chain. At this point we have completed the first (fast) phase of the catalysis.

The second phase of the catalysis by chymotrypsin is slower. It requires that the covalent bond between phenylalanine and serine&rsquos oxygen be broken so the peptide can be released and the enzyme can return to its original state. The process starts with entry of water into the active site. Water is attacked in a fashion similar to that of the serine side chain in the first phase, creating a reactive hydroxyl group that performs a nucleophilic attack on the phenylalanine-serine bond, releasing it and replacing the proton on serine. The second peptide is released in the process and the reaction is complete with the enzyme back in its original state.


Localization and function

The expression of granzymes is restricted to activated T lymphocytes, immature T cells in the thymus (thymocytes), γδ T cells (a small population of specialized T cells mainly found in the gut) and NK cells. Of these, NK cells and γδ T cells constitutively express and store granzymes, whereas in T lymphocytes the production of granzyme mRNA and proteins must be induced following exposure to antigen or following other types of stimulation. Granzymes are expressed by most CD8 + and a smaller proportion of CD4 + T cells sensitized في المختبر by antigen or lectin [8]. The gene for granzyme M is only expressed in NK cells, whereas other members of the subfamily encoded by the Met-ase locus have a much wider expression.

Granzymes undergo their final processing by DPP1 at the time of packaging into cytotoxic granules, and they are therefore stored as active enzymes, ready for exocytic release upon contact with a target cell. The granules have two zones, which can be seen at the ultrastructural level. Each has a dense central core, which contains granzymes, the granule toxin perforin and the acidic proteoglycan chondroitin sulphate (CS). The net negative charge of CS enables it to complex granzymes, which are basic and positively charged at granule pH. The outer zone of each granule has a composition more typical of an ordinary lysosome. Granules appear to be distributed randomly in the cytoplasm, but they rapidly move to the site of target-cell contact when conjugation occurs, in a process known as polarization.

Apoptotic function of granzyme B

It is clear that the principal function of granzymes is to induce the death of virus-infected and other potentially harmful cells. They achieve this by accessing key substrates within target cells in a perforin-dependent manner. Perforin-deficient mice thus have a complete deficiency of all granzyme-mediated cell-death pathways and are susceptible to both a broad variety of viral pathogens and other intracellular pathogens, such as Listeria monocytogenes [9]. Granzyme B has the strongest apoptotic activity of all granzymes, as a result of its caspase-like ability to cleave substrates at key aspartic acid residues. But mice deficient in granzyme B expression have a far milder immune deficiency than perforin-null mice, suggesting that there is a degree of functional redundancy in granzyme-induced apoptosis. In vitro, the CTLs of granzyme B-deficient mice induce DNA fragmentation in target cells much more slowly than do CTLs of wild-type littermates [10]. Granzymes other than B have far weaker apoptotic activity, best illustrated by granzyme A, a tryptase that can amplify granzyme-B-mediated cell death. Granzyme A can induce caspase activation far less efficiently than granzyme B, and exerts other pro-apoptotic effects through its ability to cleave down-stream caspase substrates.

The cell-death-inducing properties of granzyme B have recently been studied in detail. Granzyme B can cleave, and therefore activate, several procaspases directly, and can also directly cleave downstream caspase substrates, including the inhibitor of caspase-activated DNase (ICAD). It can thus contribute in a major way to DNA fragmentation in the target cell. Overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 protein in mitochondria inhibits granzyme B completely, however, indicating that mitochondrial disruption is an indispensable feature of granzyme-mediated cell death [11]. Recently, we have shown that in human and mouse cells the pro-apoptotic Bcl-2-family member Bid is cleaved specifically and rapidly by granzyme B distal to the aspartic acid residue at position 75, and that the truncated Bid molecule inserts into the mitochondrial membrane to induce the release of other pro-apoptotic mediators, including cytochrome c and Smac/Diablo [12]. In addition to caspase-dependent mechanisms, there are also caspase-independent pathways: cells in which caspase activity is abolished are nevertheless killed by granzymes, although the caspase-independent mechanisms are poorly understood but probably involve cytoskeletal disruption (Figure 3).

A schematic model of granzyme-B-mediated apoptosis. Granzyme B enters the target cell by endocytosis and leaves the endosomal compartment to access the cytosol in a perforin-dependent manner. The key cytosolic substrate for granzyme B is the pro-apoptotic Bcl-2 family member Bid, which is cleaved distal to aspartic acid at position 75. Truncated Bid (tBid) induces mitochondrial disruption, which can be inhibited by Bcl-2. Disrupted mitochondria release other pro-apoptotic mediators such as cytochrome ج and DIABLO/Smac, which subsequently induce caspase activation. Granzyme B also cleaves some caspases directly, but full caspase processing requires activation of the mitochondrial pathway through Bid. There are also caspase-independent pathways to cell death, and although they are poorly characterized, an important step in these pathways appears to be cytoskeletal disruption.

Non-apoptotic granzyme functions

A number of additional functions have also been postulated for granzymes, especially for the trypsin-like granzyme A, which may be involved in regulating B-cell proliferation. Purified mouse granzyme A can be mitogenic for B cells in the absence of antigen, much like other 'tryptases' such as thrombin and trypsin. Granzyme A can cleave a number of extracellular matrix proteins, and thus may facilitate migration of T and NK cells through extracellular tissues. Granzymes can also induce cytokine secretion and directly activate certain cytokines, and may thus amplify some forms of inflammation. Granzyme A can cleave the thrombin receptor after the sequence Leu-Asp-Pro-Arg to induce the release of the interleukins IL-6 and IL-8 from monocytoid cells and the retraction of neurites in oligodendrocytes. A role for granzymes A and B in directly controlling viral infection has been proposed, because mice with a targeted disruption of the genes for granzymes A and B were found to be profoundly susceptible to infection with the cytopathic orthopox virus, ectromelia [13]. Despite this, granzyme A-deficient mice are capable of a normal response to the noncytopathic lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and to the intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes, and they can eradicate several syngeneic tumors with kinetics similar to wild-type littermates.

Substrate specificity and inhibitors of granzymes

Granzymes have very specific substrate preferences, consistent with their role as processing, rather than degradative, enzymes. Digestive proteases, such as trypsin, chymotrypsin and elastase, have a very broad range of substrates, and the amino-acid context of the P1 residue of substrates is far less critical than for granzymes, for which up to five residues neighboring the P1 position may influence recognition and cleavage. Clear substrate preferences have been identified for granzymes A and D and tryptase-2 (all of these are tryptases these are often defined by their ability to cleave Na-CBZ-L-lysine thiobenzyl ester) and for granzyme B (an 'Asp-ase', cleaving at aspartic acid and possibly glutamic acid), granzyme M (also known as 'Met-ase' and cleaving at methionine) and granzyme H (a chymase). Granzyme B is the only mammalian serine protease that prefers acidic side chains [14], a finding of relevance for its role as a pro-apoptotic enzyme as it allows cleavage of Bid and the pro-caspases.

Various synthetic compounds, including peptide thiobenzyl ester, 7-amino-4-methylcoumarin and paranitroanilide (pNA) derivatives, have been tested to determine optimal substrates and cleavage conditions for granzymes. The optimal paranitroanilide substrates are D-Pro-Phe-Arg-pNA for mouse granzyme A and tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA for human granzyme A. Both mouse and human granzymes A are inhibited by serine protease inhibitors such as di-isopropylfluorophosphate, phenylmethylsulfonylfluoride, bezamidine, aprotinin, leupeptin and soybean trypsin inhibitor. In addition, granzyme A of both species can be blocked by a number of physiological inhibitors, such as α2-macroglobulin, antithrombin III and C1 esterase inhibitor, which may protect surrounding tissues from bystander damage following degranulation [15]. Many granzyme A inhibitors inhibit granzyme B only marginally. In one extensive study, the best inhibitor identified was human α1-protease inhibitor, which produced 85% inhibition when used at 10 μg/ml [14].

Granzyme serpins

It has recently become clear that cytotoxic lymphocytes synthesize their own inhibitors (serpins) that act in the cytosol to bind and neutralize mis-sorted or mis-packaged granzymes. Serpin PI-9, expressed in CTLs and NK cells, has glutamic acid as its P1 residue, and this choice (over aspartic acid) influences its capacity to inhibit granzyme B specifically. Bird and colleagues [16] showed that mutating the P1 residue to aspartic acid resulted in poor complex formation with granzyme B, and that the mutated molecule became capable of inhibiting caspases, unlike wild-type PI-9. Kinetic studies indicate that substituting aspartic acid for glutamic acid results in the mutated PI-9 molecule becoming a far better substrate for granzyme B, with a much faster off rate. As serpins act as pseudosubstrates and exert their inhibitory effects by irreversibly binding the protease following cleavage of their inhibitory loop, replacement of aspartic acid with glutamic acid paradoxically results in poor complex formation and poor inhibition. In cells, PI-9 is absent from cytotoxic granules but present in high concentrations in the cytosol. It can therefore block potentially toxic granzyme B molecules that leak out of CTL granules, without inhibiting caspase-dependent death of the CTL occurring through the Fas pathway [16]. Many new intracellular serpins have recently been described, and it is possible that CTLs and NK cells protect themselves with serpins specific for each of their granzymes.


Nitrogen-15 NMR spectroscopy of the catalytic-triad histidine of a serine protease in peptide boronic acid inhibitor complexes

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: In lieu of an abstract, this is the article's first page.


شاهد الفيديو: 037-Catalytic Mechanisms (أغسطس 2022).