معلومة

هل من الضروري إضافة الكوليسترول إلى أجار أو الثقافة السائلة لـ C. elegans؟

هل من الضروري إضافة الكوليسترول إلى أجار أو الثقافة السائلة لـ C. elegans؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في إعداد أطباق أجار مع NGM ، وكذلك الثقافات السائلة لزراعة الليغانس ، ما مدى أهمية إضافة الكوليسترول والمعادن الثقيلة؟ لقد أعددت كليهما. لا أستطيع ملاحظة أي فرق واضح وأنا أكره الاضطرار إلى إضافة كل هذه المكملات.

أنا أستخدم مستخلص الخميرة والببتون كمكونات أساسية للقاعدة.

أليس من المفترض أن يكون هذا مجرد ركيزة رطبة وشبه ناعمة للزحف حولها ، فإن مغذياتهم تأتي من البكتيريا التي يأكلونها.


C. ايليجانس يحتاج الكوليسترول ، لكنه لا يستطيع أن يصنعه. نظرًا لأن البكتيريا لا تصنع الكوليسترول أيضًا ، فإن بكتيريا الطعام ليست مصدرًا. كما هو موضح في الورقة المرتبطة ، يؤثر نقص الكوليسترول في النمو الطبيعي.


صيانة المختبر واستزراع فطر محاصرة النيماتودا Arthrobotrys oligospora

تعتبر الفطريات التي تصيد الديدان الخيطية (NTF) والديدان الخيطية شائعة ومتعاطفة بطبيعتها. يبقى الأساس الجزيئي الذي يقوم عليه هذا التفاعل بين المفترس والفريسة غير معهود إلى حد كبير. يمكن عزل كل من NTF والديدان الخيطية بسهولة من عينات التربة. لا تشكل NTF مصائدًا في البيئات الغنية بالمغذيات ، ومع ذلك يمكن ملاحظة تشكل المصيدة في ظل ظروف فقيرة بالمغذيات وعند الاستشعار المتزامن لإشارات الديدان الخيطية. هنا ، نقدم بروتوكولات لصيانة المختبر وزراعة نموذج NTF Arthrobotrys oligospora. © 2021 وايلي الدوريات ذ م م.

البروتوكول الأساسي 1: نمو الفطريات التي تصيد الديدان الخيطية على وسط صلب

البروتوكول الأساسي 2: نمو الفطريات التي تصيد الديدان الخيطية في الوسط السائل

البروتوكول الأساسي 3: جمع الكونيديا من وسط صلب

بروتوكول الدعم 1: تحضير قمع مرشح Miracloth

البروتوكول الأساسي 4: تحريض تشكل المصيدة

بروتوكول بديل: القياس الكمي لتحريض المصيدة

بروتوكول الدعم 2: إعداد متزامن C. ايليجانس L4

البروتوكول الأساسي 5: التأسيس C. ايليجانس معدل البقاء على قيد الحياة عند التعرض ل A. oligospora

البروتوكول الأساسي 6: تخزين سلالات الفطريات التي تصيد الديدان الخيطية


المقدمة

الستيرولات هي مكونات مهمة لغشاء بلازما الخلية حقيقية النواة. يؤثر الكوليسترول ، الموجود بشكل أساسي في الخلايا الحيوانية ، على خصائص حاجز النفاذية وسيولة طبقة الدهون الثنائية. تُظهر البيانات المتراكمة في السنوات الأخيرة أن الكوليسترول ليس فقط مكونًا هيكليًا للغشاء الذي يجعل الغشاء أقل سيولة ، ولكنه يشارك أيضًا بنشاط في تعديل إشارات الخلية. يُعتقد أن هذا التعديل يحدث عبر النطاقات الدقيقة المخصبة بالكوليسترول والجليكوسفينجوليبيد داخل غشاء البلازما ، والتي يشار إليها غالبًا باسم الأغشية المخصبة بالجليكوليبيد (GEMs) أو "الأطواف" (Simons and Ikonen ، 1997). يُنظر إلى هذه المجالات المتخصصة على أنها رابطة جانبية لدهون وبروتينات معينة يلعب فيها الكوليسترول دورًا تنظيميًا. ومع ذلك ، فإن معظم المعلومات حول المجالات الدهنية المتخصصة تأتي من دراسات في أنظمة الأغشية النموذجية (براون ولندن ، 2000) وفي خلايا زراعة الأنسجة (موخيرجي وماكسفيلد ، 2000). في هذه الدراسة ، درسنا الأدوار التي يلعبها الكوليسترول في كائن حي ، النيماتودا C. ايليجانس. إن قوة علم الوراثة وتوافر تسلسل الجينوم بأكمله يجعل هذا الكائن الحي نموذجًا ممتازًا لدراسة العديد من العمليات البيولوجية. كخطوة أولى نحو فهم حركة ستيرول وأدوارها البيولوجية في أنواع معينة انيقة، درسنا توزيع الستيرول ونقله في الديدان الحية.

واحدة من المزايا الرئيسية مع استخدام C. ايليجانس كنظام نموذجي هو أن الديدان الخيطية هي مساعدة للستيرول لأنها لا تمتلك الإنزيمات اللازمة للتخليق الحيوي للستيرول (Hieb and Rothstein ، 1968 Chitwood and Lusby ، 1991). المصادر الرئيسية للستيرولات لدودة التربة C. ايليجانس هي براز الحيوانات أو الخميرة / بقايا النباتات. C. ايليجانس ينتشر بشكل روتيني في المختبر على أطباق أجار تحتوي على الكوليسترول. وبالتالي ، يمكن استبدال ستيرولات الكائن الحي بالنظائر الفلورية أو المتفاعلة ضوئيًا للتحقيق في توزيع ووظيفة الستيرولات في الكائن الحي.

الكوليسترول في C. ايليجانس ربما يشارك في التنظيم الهيكلي والوظيفي لغشاء البلازما ، والذي يشبه الخلايا الحيوانية الأخرى. تظهر الديدان التي تنمو على أطباق مستنفدة من الكوليسترول عيوبًا في طرح الريش (Yochem وآخرون.، 1999). إذا تم استبدال الكوليسترول بنظيره غير الوظيفي 25-آزاكوبروستان ، فإن نمو الحيوانات وتكاثرها يُثبط بشدة (شيتوود وآخرون.، 1984 بوتجير وآخرون.، 1985). في الآونة الأخيرة ، أثناء التحقيق في وظيفة أ C. ايليجانس مقارنة مع caveolin ، وجدنا أن مستوى الكوليسترول في الغدد التناسلية يؤثر على نقل الإشارة (Scheel وآخرون.، 1999). على وجه الخصوص ، أدى استنفاد الكوليسترول إلى تسريع تقدم دورة الخلية الانتصافية عبر الخروج من توقف باشيتين. من المعروف أن هذه العملية ينظمها مسار Ras / MAP-kinase (Churchوآخرون., 1995).

على الرغم من الأهمية الحيوية للستيرولات بالنسبة للدودة ، إلا أن توزيع الكوليسترول والآليات الجزيئية لنقلها غير مفهومة جيدًا. ليس من الواضح حتى ما إذا كان يتم تناول الستيرولاتC. ايليجانس عن طريق الجهاز الهضمي أو من خلال البشرة. لا يُعرف سوى القليل جدًا عن الجزيئات المشاركة في نقل الكوليسترول إلى أعضاء مختلفة من الدودة أو الأجنة البالغة. أحد المرشحين الذي تم تحديده مسبقًا لامتصاص الكوليسترول هو متماثل لـ gp330 / megalin ، وهو عضو في عائلة مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) (Yochem). وآخرون.، 1999). ومع ذلك ، فإن توطينه الحصري على السطح القمي من اللحمة يدعو للتساؤل حول تورط هذا المستقبل في امتصاص الكوليسترول من قبل القناة الهضمية. من المثير للاهتمام أن CHE-14 هو بروتين آخر محتمل مرتبط بالكوليسترول تم وصفه مؤخرًا ، والذي تم تحديد موقعه في الجانب القمي لخلايا الأديم الظاهر (Michaux وآخرون., 2000).

كان أحد أسباب ندرة المعلومات عن توزيع الكوليسترول ونقله هو الافتقار إلى طرق لتصوير الكوليسترول أو لتحديد البروتينات المرتبطة بالكوليسترول. حتى وقت قريب ، كانت الطرق غير المباشرة فقط متاحة (Liscum and Dahl ، 1992 Liscum and Munn ، 1999). الشفافية البصرية C. ايليجانس يوفر فرصة فريدة لتطبيق مناهج التصوير الفلوري ووسم الانجذاب الضوئي في كائن حي بأكمله. ومع ذلك ، لم يكن تصوير الستيرولات البيولوجية في الخلايا الحية ممكنًا حتى وقت قريب بسبب عدم وجود مسبار الفلورسنت المناسب الذي يحاكي الخصائص الفيزيائية الحيوية والكولسترول. Dehydroergosterol (DHE ، الشكل 1 أ) هو نظير فلوري طبيعي للكوليسترول يحاكي العديد من خصائصه (شرودر وآخرون.، 1991 ، 1995) ، لكنه لم يكن مفيدًا بشكل عام للتصوير المجهري لأنه يمتص في منطقة الأشعة فوق البنفسجية البعيدة وينبعث في منطقة الأشعة فوق البنفسجية القريبة من الطيف. في الآونة الأخيرة فقط ، باستخدام كاميرا ذات كفاءة عالية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية بالإضافة إلى إنتاجية عالية للأشعة فوق البنفسجية لمختلف المكونات البصرية للمجهر ، كان من الممكن تصوير DHE وبالتالي اكتشاف توزيع الستيرول في الخلايا الحية المستزرعة (Mukherjee) وآخرون.، 1999). على النقيض من ذلك ، فإن وضع العلامات على الخلايا التي تحتوي على مشتق فلوري من الكوليسترول ، 25-NBD-cholesterol ، يختلف اختلافًا كبيرًا عن الملصق باستخدام DHE ، بما في ذلك وضع العلامات على العضيات مثل الغلاف النووي المعروف باحتوائه على مستويات منخفضة من الستيرول. أعطى مضاد حيوي من البوليين الفلوري المرتبط بالكوليسترول ، filipin ، تصنيفًا مشابهًا على الرغم من اختلافه كميًا للخلايا مقارنة بـ DHE (Mukherjee وآخرون.، 1999). في تجاربنا الأولية وجدنا أن تطبيق الفلبين للدراسات في الحياة C. ايليجانس معقد بسبب ضعف قدرة هذا الكاشف على اختراق الأعضاء الداخلية للدودة. علاوة على ذلك ، فإن التألق الذاتي للديدان في منطقة طيف الانبعاث الفلبيني مرتفع للغاية ، مما يجعل اكتشافه في الحيوانات التي تم تشريحها شبه مستحيل.

التين. 1. تراكيب DHE و [3 H] فوتو كوليسترول.

يأتي تقدم آخر في دراسة نقل الكوليسترول من التوليف الأخير للكوليسترول النشط بيولوجيًا والقابل للتنشيط الضوئي ، [3 H] فوتو كولسترول (الشكل 1 أ). لقد أتاح هذا التناظرية تحديد البروتينات التي تربط الكوليسترول في الجسم الحي (Thiele وآخرون., 2000).

في هذه الدراسة استخدمنا DHE و [3 H] فوتو كولسترول للتحقيق في توزيع الستيرول في الدودة وللتعرف على الجزيئات المشاركة في نقلها. لقد أظهرنا أنه على عكس الكوليسترول الفلبيني أو 25-NBD-Colesterol ، يتراكم DHE على وجه التحديد في أنسجة معينة من الدودة. موقعان رئيسيان للتراكم هما البويضات والحيوانات المنوية النامية. باستخدام الكولسترول الضوئي [3 H] ، حددنا الفيتيلوجينين كشركاء تفاعل مع الكوليسترول ، ووجدنا أنrme-2 الديدان ، التي تفتقر إلى مستقبلات vitellogenin (Grant and Hirsh ، 1999) ، تفشل في تراكم DHE في البويضات والأجنة. لأن فيتيلوجينين لها تماثل مع البروتين الشحمي B-100 في الثدييات (Baker ، 1988 Spieth وآخرون.، 1991) ، ومستقبل vitellogenin ، RME-2 ، هو عضو في عائلة مستقبلات LDL الفائقة (Grant and Hirsh ، 1999) ، ويمكن اعتبار vitellogenins ومستقبلاتها بمثابة أسلاف تطورية لـ LDL ومستقبلاته في الكائنات الحية العليا. أدى نهج الربط الضوئي أيضًا إلى تحديد بروتين 37 كيلو دالتون الذي يربط الكوليسترول في المخنثين وكذلك عند الذكور.


البروتوكول البديل 1

حقن مكروي في unc-42 rde-1 عبرت الحيوانات إلى ذكور N2 لفحص الأنماط الظاهرية الزيجوتية RNAi

إذا أدى RNAi عن طريق الحقن المجهري (انظر البروتوكول الأساسي 1) إلى توقيف الجنين ، فقد يعكس ذلك وظيفة الأم للجين المستهدف. يمكن فحص النشاط الزيجوتيكي للجين المستهدف عن طريق حقن الرنا المزدوج الجديلة في الحمض النووي الريبي الناقص (rde متحولة) خنثى تزاوج مع ذكر N2 من النوع البري (الشكل 26.3.4). في هذا السيناريو ، لن يتأثر نشاط الأم للجين المستهدف لأن RNAi لا يعمل في rde خنثى متحولة. ومع ذلك ، فإن الذكور البرية التي تتزاوج بنجاح مع rde سيوفر خنثى متحولة نشاط RNAi في السلالة المتقاطعة ، وبالتالي إسكات التعبير اللاقحي للجين المستهدف. لتسهيل تحديد rde/ + ذرية متقاطعة ، أ rde متحولة مميزة بطفرة مرئية متنحية & # x02014e.g. ، غير منسقة (Unc) & # x02014is متزاوجة مع ذكور N2 ، محقونة بـ dsRNA ، والنسل المتصالب non-Unc الذي تم فحصه بحثًا عن الأنماط الظاهرية الناتجة عن فقدان النشاط البقعي للمستهدف الجين.

رسم تخطيطي لإجراء اللاقحة RNAi.

مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكول الأساسي 1)

unc-42 rde-1 C. ايليجانس (WM36 CGC)

الكواشف والمعدات الإضافية للنقل والتكاثر (انظر بروتوكول الدعم 1) والتزاوج C. ايليجانس

ماتي وايلد من نوع (N2) C. ايليجانس الذكور مع unc-42 rde-1 سلالة متحولة بين عشية وضحاها (انظر دعم بروتوكول 2 الأمل ، 1999).

حقن الرنا المزدوج الجديلة في المخنثين Unc التزاوج (انظر البروتوكول الأساسي 1).

نقل (انظر بروتوكول الدعم 1) كل خنثى محقون إلى لوحات التزاوج الفردية مع الذكور للتعافي (أي احتضان في 20 & # x000b0C) بين عشية وضحاها ومواصلة التزاوج (انظر بروتوكول الدعم 2).

نقل خنثى وحدها إلى لوحة NGM جديدة وتسجيل ذرية غير متقاطعة لأنماط RNAi كما هو موضح أعلاه.


مقايسة التسامح البارد لدراسة التعود البارد المعتمد على درجة حرارة الزراعة في C. elegans

درجة الحرارة هي عامل بيئي حاسم ومستمر يؤثر بشكل مباشر على العمليات الكيميائية الحيوية داخل الكائنات الحية. قد تعتاد الحيوانات على تغير درجة حرارة البيئة باستخدام مجموعة من الآليات. لاستكشاف آليات التعود على درجة الحرارة ، قمنا بتعريض النيماتودا Caenorhabditis elegans إلى درجة حرارة 2 درجة مئوية ، وهي أبرد بكثير من درجة حرارة نموها الطبيعية (حوالي 10-28 درجة مئوية) وقمنا بتقييم معدل بقائها على قيد الحياة في التعافي من هذه الصدمة الباردة. كان معدل البقاء على قيد الحياة بعد الصدمة الباردة مختلفًا بين الحيوانات التي نمت في درجة حرارة 15 درجة مئوية و 25 درجة مئوية ، مما يشير إلى أن C. elegans يُظهر تحمل البرد المرتبط بدرجة الحرارة. نعرض هنا بالتفصيل بروتوكولين: اختبار قياسي للتسامح البارد بعد الزراعة عند درجة حرارة ثابتة ومقايسة تحمل البرد متعددة الخطوات بدرجات حرارة متغيرة. (ساهم T.U. & amp A.O. بالتساوي في هذا العمل.)

مقدمة

قد تتغير الظروف البيئية التي تتعرض لها الكائنات الحية باستمرار. لذلك ، تمتلك الحيوانات مجموعة متنوعة من الآليات التي تكيف أنشطتها البدنية أو السلوكية مع هذه التغييرات. تسبب درجة الحرارة تغيرات كيميائية حيوية مباشرة داخل الكائنات الحية وهي عامل حاسم لبقائها على قيد الحياة. تظهر الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans ظواهر تستجيب لدرجة الحرارة. يعد تحريض يرقات الداور والتنجيم الحراري ردودًا معروفة جيدًا لدرجة الحرارة العالية 1،2،3 ، ولكن لم يتم فهم كيفية تعويد C. elegans على درجة الحرارة الباردة. C. elegans غير قادر على التكاثر تحت 10 درجات مئوية ولكن التقارير السابقة أشارت إلى وجود تحمل البرد في هذا النوع. يتم تنظيم التحمل البارد الذي يتيح البقاء على قيد الحياة عند 2-4 درجة مئوية لعدد من الساعات عن طريق تشبع الفسفوليبيد ومسار الشيخوخة 4،5. أفاد Xiao et al أن درجة حرارة المزرعة تؤثر على طول عمر المسوخات المعيبة لـ TRPA-1 الحساسة للبرد 6. وقد أبلغنا مؤخرًا أن الخلايا العصبية ASJ المستشعرة للضوء والفيرومون تكتشف درجة الحرارة وتتحكم في تحمل البرودة من خلال إشارات الأنسولين 7. وهذا يعني أن زوج من الخلايا العصبية الحسية يعزز مقاومة درجات الحرارة الباردة في الأنسجة الأخرى. نقدم هنا اختبارنا للتسامح البارد بعد تجربة درجة الحرارة السابقة.

يمكن تغيير الحالة الثابتة لتحمل البرد في غضون ثلاث ساعات أو أكثر من الحضانة عند درجة حرارة جديدة ، مما يشير إلى أن درجة حرارة الزراعة مخزنة في مكان ما ويمكن استبدالها في غضون ساعات قليلة من تجربة جديدة 7. هنا أيضًا نصف درجة حرارة الزراعة لدينا مقايسة التسامح الباردة المنزاحة.

المواد

  1. وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنف بـ E. coli (OP-50)
    • لقد صنعنا NGM بشكل أساسي وفقًا للبروتوكول الأصلي من قبل Brenner مع بعض التعديلات 8 ، 9 ، على النحو التالي.
    • امزج 3 جم كلوريد الصوديوم ، 20 جم أجار (Ina ، اليابان) ، 2.5 جم Bacto Peptone (BD Falcon) و 975 مل من H2O في دورق مخروطي مع قضيب التحريك والأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة. برد الوسط المعقم حتى 50 درجة مئوية مع التحريك ثم أضف 1 مل من MgSO4 (1 م) ، 1 مل من CaCl2 (1 م) ، 25 مل من فوسفات البوتاسيوم (1 م ، درجة الحموضة 6.0) و 1 مل من الكوليسترول (5 ملغ) / مل في الإيثانول). قم بتوزيع 14 مل من أطباق بتري ذات قطر متوسط ​​إلى 60 مم ، أو أطباق بتري بقطر 6 مل إلى 35 مم ، مع موزع أوتوماتيكي معقم. بعد ذلك ، يتم زرع البذور السائلة للإشريكية القولونية OP-50 على وسط جيد التصلب.
  2. الديدان
    • نمت الحيوانات البالغة تحت ظروف تغذية جيدة.

ادوات

  1. حاضنات
    • استخدمنا نماذج الحاضنة CRB-14A (Hitachi ، اليابان) أو FMU-2041 (Fukushima Industries Corp. ، اليابان) لزراعة الديدان عند 15-25 درجة مئوية واستخدمنا نموذج CRB-41A أو CRB-14A (هيتاشي ، اليابان) ثلاجة لحضانة الصدمة الباردة عند 2 درجة مئوية.

إجراء

مقايسة لتحمل البرد الناجم عن تجربة درجة الحرارة (الشكل 1 ، 2).

الشكل 1: الفحص لتحمل البرد الناجم عن تجربة درجة الحرارة. بعد وضع البيض ، قم بإزالة الحيوانات P0 من لوحة الاختبار. زراعة في درجة حرارة ثابتة حتى يصل البيض إلى مرحلة البلوغ ، ونقل اللوحة إلى بيئة 2 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، احسب معدل البقاء على قيد الحياة وقارنه مع معدل البقاء على قيد الحياة من النوع البري.

الشكل 2: الحيوانات على لوحات الفحص بعد الصدمة الباردة. تُظهر هذه الصور الحيوانات على لوحات الفحص في نهاية فترة الصدمة الباردة (2 درجة مئوية لمدة 48 ساعة) من النوع البري N2 ، التي نمت سابقًا عند 15 درجة مئوية (أ) أو 25 درجة مئوية (ب) من البيض إلى بالغ.

  1. زراعة C. ايليجانس للبالغين في ظل ظروف التغذية الجيدة. ضع اثنين من الديدان الخيطية البالغة (P0) على NGM في ألواح قطرها 60 مم ، وهي لوحات الفحص في الإجراء التالي.
  2. احتضان لوحات الفحص في كل درجة حرارة تجريبية لمدة 8-12 ساعة ، حتى الكبار P0 وضعوا حوالي 100 بيضة.
  3. قم بإزالة جميع البالغين P0 لمزامنة مراحل الديدان الخيطية
  4. احتضان لوحات الفحص حتى تتطور النسل إلى مرحلة البالغين في درجات الحرارة الخاصة بكل منها ، على سبيل المثال:
    • 15 درجة مئوية ، تزرع لمدة 144-150 ساعة
    • 20 درجة مئوية ، تزرع لمدة 85-90 ساعة
    • 25 درجة مئوية ، تزرع لمدة 60-65 ساعة
  5. ضع لوحات الفحص التي تحتوي على حيوانات بالغة ناضجة - وليست قديمة - مباشرة على الجليد لمدة 20 دقيقة. لاحظ أن ألواح الفحص يجب أن تكون مختومة بواسطة بارافيلم مع نصف قيعان أجار فقط ملامسة للجليد.
  6. ضع لوحات الفحص في وعاء بلاستيكي بغطاء وانقلها إلى الثلاجة عند 2 درجة مئوية.
  7. احتضان لوحات الفحص عند 2 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  8. تخزين لوحات الفحص عند 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  9. احسب عدد الحيوانات الناضجة والحيوية ، واحسب معدل البقاء على قيد الحياة.
    • يتم إجراء تسعة فحوصات على الأقل (الخطوات من 1 إلى 9) لكل سلالة. احسب معدلات البقاء على قيد الحياة والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) للبيانات المأخوذة من أكثر من تسع لوحات فحص.
    • إذا كانت معدلات نمو المسوخ أبطأ أو أسرع من الأنواع البرية ، فقم بتحويل يوم التمديد (الخطوة 2) لمزامنة بداية التعرض البارد للأنواع البرية والطفرات.
    • إذا كان للطفرات النمط الظاهري لتشكيل dauer (daf-c) ، فقم بزراعتها عند 15 درجة مئوية من البيض إلى يرقات L4 ثم قم بزراعتها طوال الليل عند درجة الحرارة المحددة (20 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية) قبل الصدمة الباردة.

مقايسة التسامح الباردة المحولة درجة حرارة الزراعة

في هذا الاختبار ، تُزرع الحيوانات من البيض إلى اليافعين أو يرقات L4 عند درجة حرارة واحدة ثم تُزرع عند درجة حرارة ثانية لبضع ساعات قبل الصدمة الباردة.

  1. زراعة C. ايليجانس للبالغين في ظل ظروف التغذية الجيدة. ضع حيوانين بالغين (P0) على NGM في ألواح قطرها 60 مم ، وهي لوحات الفحص في الإجراء التالي. يتم استخدام ثلاث لوحات فحص من نفس السلالة لمقايسة واحدة.
  2. احتضان لوحات الفحص في درجة الحرارة الأولى لمدة 8-12 ساعة حتى الكبار P0 وضعوا حوالي 100 بيضة.
  3. قم بإزالة جميع البالغين P0 لمزامنة مراحل الديدان الخيطية.
  4. احتضان لوحات الفحص حتى تتطور النسل إلى الشباب أو البالغين في درجة الحرارة الأولى ، على سبيل المثال:
    • 15 درجة مئوية ، تزرع لمدة 132-150 ساعة
    • 20 درجة مئوية ، تزرع لمدة 72-90 ساعة
    • 25 درجة مئوية ، تزرع لمدة 52-65 ساعة
      • إذا تضمنت الخطوة 5 حضانة 18 ساعة فوق 20 درجة مئوية ، فمن الأفضل الانتقال إلى هذه الخطوة عندما تكون الحيوانات يرقات L4.
  5. نقل لوحات الفحص إلى حاضنة أخرى في درجة الحرارة الثانية واحتضانها لعدة ساعات (على سبيل المثال ، 0 ، 3 ، 5 ، 8 ، أو 18 ساعة).
  6. بعد الحضانة في درجة الحرارة الثانية ، ضع لوحات الفحص على الجليد لمدة 20 دقيقة. لاحظ أن ألواح الفحص يجب أن تكون مختومة بواسطة بارافيلم مع نصف قيعان أجار فقط ملامسة للجليد.
  7. ضع لوحات الفحص في وعاء بلاستيكي بغطاء وانقلها إلى الثلاجة عند 2 درجة مئوية
  8. احتضان لوحات الفحص عند 2 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  9. تخزين لوحات الفحص عند 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. احسب عدد الحيوانات الناضجة والحيوية ، واحسب معدل البقاء على قيد الحياة.
    • كرر الفحص ثلاث مرات مع ثلاث لوحات فحص لكل منها واحسب معدلات البقاء على قيد الحياة والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) للبيانات من أكثر من تسع لوحات فحص.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

يبدو أن النمط الظاهري لتحمل البرد يتأثر بشدة بالرطوبة وعوامل أخرى غير معروفة. على وجه الخصوص ، يتم ملاحظة هذه التأثيرات أثناء تغيرات الموسم. في اليابان ، تتغير هذه الأنماط الظاهرية بشكل ملحوظ في موسم الأمطار. إذا تم تغيير التسامح البارد للسلالات الطافرة ، فيجب تغيير درجة حرارة الصدمة الباردة أو وقت الصدمة الباردة ، على سبيل المثال ، من 2 درجة مئوية إلى 3.5 درجة مئوية و / أو 24 ساعة إلى 72 ساعة.

إذا تم استخدام لوحات NGM بقطر 35 مم ، فيجب تقليل عدد البيض الذي يضعه البالغون P0 إلى أقل من 100 وتقليل وقت وضع البيض ، أو تقليل عدد P0 لكل لوحة فحص.

يختلف استقرار درجة الحرارة بشكل ملحوظ بين النماذج المختلفة للحاضنة أو الثلاجة. قمنا في كثير من الأحيان بمراقبة درجة الحرارة الداخلية للحاضنات والثلاجة باستخدام مقياس حرارة رقمي HA-100K (أنريتسوم ، اليابان).

مراجع

  1. Golden، J.W & amp Riddle، D. L. يرقة Caenorhabditis elegans dauer: التأثيرات التطورية للفرمون والغذاء ودرجة الحرارة. علم الأحياء النمائي 102, 368-378 (1984).
  2. Hedgecock، E. M. & amp Russell، R.L. عادي ومتحور حراري في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 72، 4061-4065 (1975).
  3. Ohta ، A. & amp Kuhara ، A. آلية جزيئية للتحسس الحراري المقترن بالبروتين G ثلاثي الأبعاد والتنظيم المشبكي في دائرة استجابة درجة الحرارة لـ Caenorhabditis elegans. بحوث علم الأعصاب 76 ، 119-124 ، دوى: 10.1016 / j.neures.2013.03.008 (2013).
  4. Murray ، P. ، Hayward ، S. A. ، Govan ، G.G ، Gracey ، A. Y. & amp Cossins ، A.R. اختبار صريح لفرضية تشبع الفسفوليبيد للتسامح البارد المكتسب في Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 104 ، 5489-5494 ، دوى: 0609590104 [pii] 10.1073 / pnas.0609590104 (2007).
  5. جينات Savory و F. R. و Sait و S.M & amp Hope و I. A. DAF-16 و Delta9 desaturase تعزز التحمل البارد في طفرات Caenorhabditis elegans طويلة العمر. بلوس واحد 6 ، e24550 ، دوى: 10.1371 / journal.pone.0024550 PONE-D-11-11397 pii.
  6. شياو ، ر. وآخرون. يعمل برنامج وراثي على تعزيز طول عمر C. elegans في درجات الحرارة الباردة عبر قناة TRP حساسة للحرارة. زنزانة 152 ، 806-817 ، دوى: 10.1016 / j.cell.2013.01.020 S0092-8674 (13) 00072-X pii.
  7. Ohta، A.، Ujisawa، T.، Sonoda، S. & amp Kuhara، A. الضوء والخلايا العصبية المستشعرة للفيرومون تنظم التعود على البرد من خلال إشارات الأنسولين في Caenorhabditis elegans. اتصالات الطبيعة 5 ، 4412 ، دوى: 10.1038 / ncomms5412 (2014). 8 برينر ، س. علم الوراثة من Caenorhabditis elegans. علم الوراثة 77 ، 71-94 (1974). 9 Stiernagle، T. صيانة C. elegans. WormBook: المراجعة عبر الإنترنت لبيولوجيا C. elegans ، 1-11 ، دوى: 10.1895 / wormbook.1.101.1 (2006).

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مختبر Kuhara على دعم التجارب وتحفيز النقاش أ.ك. حصل على الدعم من جائزة ناريشيجي لعلوم الحيوان ، ومؤسسة توراي للعلوم ، ومؤسسة سوميتومو ، ومؤسسة أستيلاس ، ومؤسسة سينري لعلوم الحياة ، ومؤسسة شيمادزو ، ومؤسسة نوفارتيس ، ومؤسسة ميتسوبيشي ، ومؤسسة نايتو ، ومؤسسة كاسيو ، والأبحاث مؤسسة علم البصريات والتكنولوجيا ، ومؤسسة Asahi Glass ، ومؤسسة Hirao Taro التابعة لجامعة Konan ، و JSPS KAKENHI ، ومنحة مساعدة للعلماء الشباب (A) ومنحة مساعدة للبحث الاستكشافي الصعب ، ومنحة - المعونة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان. أ. كان مدعومًا من مؤسسة ساساغاوا للعلوم ومؤسسة نايتو وجائزة ناريشيج لعلوم الحيوان ومنحة مساعدة لزملاء JSPS (KAKENHI) ، اليابان.

المصدر: Protocol Exchange (2014). نُشر في الأصل على الإنترنت في 8 سبتمبر 2014


نقاش

DHE و [3 H] فوتو كوليسترول كأدوات لدراسة توزيع ونقل الكوليسترول في الجسم الحي

التحقيق في امتصاص الكوليسترول وتوزيعه في الخلايا أو الكائنات الحية له أهمية كبيرة ، و C. ايليجانسمناسب تمامًا لمثل هذه الدراسات. إنه صغير وشفاف بصريًا ، مما يجعل التطبيقات الممكنة للتصوير الفلوري أو وضع العلامات على الانجذاب الضوئي في الكائنات الحية الكاملة. بالإضافة إلى ذلك ، سلالات متحولة من C. ايليجانس يمكن استخدامها لتحديد الآليات الجزيئية لنقل الستيرول وتنظيمه. بسبب طبيعتها غير الغازية ، توفر DHE القدرة على متابعة امتصاص وتوزيع الكوليسترول في الكائنات الحية ، بينما [3 H] فوتو كوليسترول هو كاشف ممتاز لتحديد البروتينات المرتبطة بالكوليسترول. كلاهما يحاكي الكوليسترول بشكل موثوق في الجسم الحي في أنظمة الثدييات (Mukherjee وآخرون.، 1999 ثيل وآخرون.، 2000) ، وكما هو موضح هنا ، يمكنهم أيضًا دعم نمو وتطور C. ايليجانس تفتقر إلى مصادر أخرى من الستيرولات.

تخصيب الكوليسترول في خلايا الخط الجرثومي

تُظهر تجارب وسم DHE في الجسم الحي أن تراكم الكوليسترول هو الأكثر بروزًا في البلعوم والحلقة العصبية وخلايا الغدة المفرزة والأمعاء وخلايا الخط الجرثومي. لا يمكن تفسير علامات DHE للسطح القمي للبلعوم والأمعاء تمامًا عن طريق الاتصال المباشر مع الطعام المحتوي على DHE لأن يرقات L1 المستمدة من الأمهات المغذيات بـ DHE ، ولكنها تفقس في غياب DHE ، تعرض مضانًا قميًا قويًا لـ DHE في الأمعاء. بدلاً من ذلك ، يشير نمط DHE إلى إثراء حقيقي للكوليسترول في هذه الأغشية. قد تكون هناك حاجة لتخصيب الكوليسترول في السطح القمي للبلعوم والأمعاء لجعله صلبًا أو مقاومًا للظروف البيئية القاسية في التجويف. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة في أنظمة الثدييات إلى أهمية المجالات الغنية بالكوليسترول في الميكروفيلي للخلايا الظهارية (Röper وآخرون.، 2000). أهمية تراكم الكوليسترول في الحلقة العصبية ، وهي بنية مؤلفة بالكامل من عمليات محور عصبي غير معروفة ، على الرغم من أنه يُعتقد أن المجالات الغنية بالكوليسترول مهمة لفرز المحاور مقابل البروتين التغصني في الأنظمة الأخرى (Ledesma وآخرون.، 1998). من المعروف أن هذه الخلايا العصبية تشارك في العديد من العمليات الحسية بما في ذلك الانجذاب الكيميائي ، أو الانجذاب الحراري ، أو اتخاذ قرار لتشكيل يرقات الباور (Bargmann and Mori ، 1988).

إن تخصيب البويضة بالكوليسترول ليس مفاجئًا لأن هذه الخلايا يجب أن تخزن مستويات عالية من مكونات الغشاء من أجل تسهيل نمو وتطور الجنين بسرعة. بعد تكوين قشر البيض ، لا يمكن امتصاص إضافي من البيئة المحيطة.

في المقابل ، فإن سبب التراكم المرتفع للكوليسترول في الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية ليس واضحًا. كمية الكوليسترول في الحيوانات المنوية مقارنة بكمية البويضة الأكبر حجمًا ضئيلة ، مما يجعل من غير المحتمل أن تلعب دورًا مهمًا في إمداد الجنين النامي. تُظهر تجاربنا ودراساتنا المنشورة أن تراكم الكوليسترول في الحيوانات المنوية بحد ذاته ليس ضروريًا للتخصيب. على سبيل المثال ، من المعروف أن استنفاد الكوليسترول عن طريق النمو في وسط خالٍ من الكوليسترول أو النمو على 25 آزاكوبروستان ، وهو نظير غير وظيفي للكوليسترول ، ليس له تأثير واضح على الجيل الأول من الحيوانات المعالجة (شيتوود) وآخرون.1984 بوتجر وآخرون.، 1985 يوشيم وآخرون.، 1999). يظهر الجيل الثاني فقط عيوبًا في الريش والنمو.

علاوة على ذلك ، يؤدي الاستنفاد الكلي للكوليسترول في الغدد التناسلية إلى زيادة نشاط وضع البيض ، وتسريع دورة الخلية الانقسام ، والخروج من توقف باشيتين (Scheel). وآخرون.، 1999). في الثدييات ، تكون الحيوانات المنوية التي يتم قذفها حديثًا غير نشطة وتحتاج إلى أن يتم تكثيفها بواسطة عدة عوامل (تشانغ ، 1951 أوستن ، 1952). ثبت جيدًا أن تدفق الكوليسترول يلعب دورًا مهمًا في تكثيف الحيوانات المنوية للثدييات (Langlais وآخرون.، 1988). يؤدي هذا التدفق إلى إطلاق سلسلة إشارات تتضمن فسفرة العديد من بروتينات الحيوانات المنوية وارتفاع تركيز Ca 2+ (Visconti وآخرون.، 1999). من المغري التكهن بأن عملية التكثيف هذه محفوظة تطوريًا ، وأن النيماتودا لديها آليات مماثلة لإبقاء الحيوانات المنوية غير نشطة حتى اللحظة المناسبة. يمكن أن يعمل الكوليسترول في الحيوانات المنوية كمنظم سلبي ، ويسيطر على هذه العملية ، وقد يكون تدفقه ضروريًا للتخصيب الناجح.

بروتينات الصفار كناقلات للكوليسترول

تتمثل إحدى النتائج الرئيسية لهذه الدراسة في أن الفيتيلوجينين يربط الكوليسترول ويشارك بشكل مباشر في نقله إلى البويضات. تجانس تسلسل C. ايليجانستم الإبلاغ عن بروتينات الصفار إلى البروتينات الدهنية منذ 10 سنوات (Baker ، 1988 Spieth وآخرون.، 1991). التحديد الأخير لـ RME-2 كمستقبل لفيتيلوجينين في C. ايليجانسعزز التشابه الظاهر بين الالتقام الخلوي لـ LDL وبروتينات الصفار لأن RME-2 هو عضو جديد في عائلة مستقبلات LDL الفائقة (Grant and Hirsh ، 1999 Willnow وآخرون.، 1999). أيضًا ، في الكائنات الحية الأخرى ، لوحظ التماثل بين مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة ومستقبلات البروتين الصفار (Bujo وآخرون.، 1994 Schonbaumوآخرون.، 1995). على الرغم من هذه المؤشرات ، لم يتم تقديم أي بيانات عن التفاعلات المباشرة بين الفيتيلوجينين والكوليسترول. علاوة على ذلك ، لأن مجمعات الفيتيلوجينين المعزولة من البويضات تحتوي على القليل من الكوليسترول (Sharrock وآخرون.، 1990) ، تم إهمال تورط فيتيلوجينين في نقل الكوليسترول. تظهر عدة أنواع من البيانات المقدمة هنا دورًا حاسمًا لفيتيلوجينين ومستقبلاتها في نقل الكوليسترول. فيrme-2 الطفرات التي تفتقر إلى مستقبلات فيتيلوجينين ، يتضاءل بشدة امتصاص الستيرول في البويضات. علاوة على ذلك ، التحليل في rme-2 متحولة أظهرت أن الجزء الأكبر من الكوليسترول قبل نقله إلى البويضات يتواجد في مجمعات 8S و 12S من فيتيلوجينين. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من احتواء مركب 12S على المزيد من [3 H] فوتو كولسترول ، فإن فيتيلوجينين YP170B الذي يشكل مركب 8S كان مرتبطًا بشكل متبادل مع [3 H] فوتو كوليسترول إلى حد كبير. إما أن YP170B يربط الكوليسترول بشدة أو كوليسترول الفوتو [3 H] فإن مركب 12S يتم إعاقته بشكل ستريمي من الارتباط بـ YP170A تساهميًا.

وجدنا أن هناك القليل من كولوكلونين DHE و vitellogenins داخل البويضات. نفترض أنه بعد فترة وجيزة من الامتصاص في النظام الداخلي للبويضة ، يتم تحرير الكوليسترول من مجمعات فيتيلوجينين ويتم إعادة توزيعه بسرعة على الأغشية الخلوية. قد يفسر هذا سبب اكتشاف الدراسات السابقة وجود القليل جدًا من الكوليسترول المركب بالفيتيلوجينين المعزول من البويضات (Sharrock) وآخرون., 1990).

من الواضح أن فيتيلوجينين لا يمكن أن يكون الناقل الوحيد للكوليسترول في الدم C. ايليجانس. يبدأ امتصاص الكوليسترول من قبل يرقات الخنثى في وقت أبكر بكثير من التعبير عن بروتينات الصفار. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعبر الذكور عن الفيتيلوجينين ولكنهم ما زالوا يتراكمون مستويات كبيرة من الكوليسترول. حددنا بروتينًا مرتبطًا بالكوليسترول بقدرة 37 كيلو دالتون ، شائعًا للذكور والمخنثين طوال دورة الحياة. هذا البروتين مرشح ليكون ناقلًا عامًا للكوليسترول في الدم C. ايليجانس وقد يكون مسؤولاً عن غالبية نقل الكوليسترول المستقل عن الفيتيلوجينين.

تظهر النتائج المقدمة في هذه المقالة أن استخدام النظائر الكيميائية للكوليسترول التي تكون إما ضوئية أو فلورية بشكل طبيعي توفر مجموعة قوية من الأدوات للتحقيق في نقل الكوليسترول وتوزيعه في كائن حي. تظهر النتائج الأولية لهذا النهج ، التي تم الإبلاغ عنها هنا ، تشابهًا ملحوظًا في جانبين من جوانب حركة ستيرول بينهما C. ايليجانس والثدييات. أولاً ، لاحظنا تراكمًا مذهلاً للستيرول في نمو الحيوانات المنوية ، وهو أمر غير ضروري للإخصاب. هذا يذكرنا بمستويات الكوليسترول المرتفعة في الحيوانات المنوية للثدييات ، والتي تنخفض كجزء أساسي من عملية التكثيف. أخيرًا ، وجدنا أن نظام مستقبلات vitellogenin: vitellogenin تستخدمه البويضات لاستيراد الستيرولات ، مما يشير إلى أن هذا هو سلف تطوري لنظام مستقبلات LDL: LDL. يجب أن تكون الطرق الموضحة في هذه المقالة مفيدة لدراسة العديد من الجوانب الأخرى للنقل والتنظيم بالستيرول.


تحليل دورة الخلية في ملف C. ايليجانس Germline مع Thymidine Analog EdU

يتم وصف طريقة قائمة على التصوير يمكن استخدامها لتحديد المرحلة S وتحليل ديناميكيات دورة الخلية في C. ايليجانس السلالة الجرثومية خنثى باستخدام النظير الثيميدين EdU. لا تتطلب هذه الطريقة أي جينات محورة وهي متوافقة مع تلطيخ الفلورسنت المناعي.

الملخص

يستخدم تحليل دورة الخلية في حقيقيات النوى بشكل متكرر مورفولوجيا الكروموسوم والتعبير و / أو توطين المنتجات الجينية المطلوبة لمراحل مختلفة من دورة الخلية ، أو دمج نظائر النيوكليوزيد. خلال المرحلة S ، تدمج بوليمرات الحمض النووي نظائر الثيميدين مثل EdU أو BrdU في الحمض النووي الصبغي ، مما يشير إلى الخلايا للتحليل. ل C. ايليجانسيتم تغذية الديدان أثناء الزراعة العادية بالنيوكليوزيد النظير EdU وهو متوافق مع تقنيات الفلورسنت المناعي. السلالة الجرثومية C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوي لدراسات مسارات الإشارات ، والخلايا الجذعية ، والانقسام الاختزالي ، ودورة الخلية لأنه شفاف وسهل وراثيًا ، وتحدث الطور الانتصافي والتمايز الخلوي / تكوين الأمشاج بطريقة شبيهة بالتجميع الخطي. تجعل هذه الميزات من EdU أداة رائعة لدراسة الجوانب الديناميكية لخلايا التدوير الانقسامي وتطوير الخط الجرثومي. يصف هذا البروتوكول كيفية تحضير بكتيريا EdU بنجاح ، وإطعامها إلى النوع البري C. ايليجانس الخنثى ، تشريح الغدد التناسلية ، وصمة لدمج EdU في الحمض النووي ، وصمة عار مع الأجسام المضادة للكشف عن دورة الخلية المختلفة وعلامات النمو ، وتصوير الغدد التناسلية وتحليل النتائج. يصف البروتوكول الاختلافات في الطريقة والتحليل لقياس مؤشر المرحلة S ، ومؤشر الطور M ، ومدة G2 ، ومدة دورة الخلية ، ومعدل الدخول الانتصافي ، ومعدل تقدم الطور الانتصافي. يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة دورة الخلية أو تاريخ الخلية في الأنسجة الأخرى والمراحل والخلفيات الجينية والظروف الفسيولوجية.

مقدمة

في تطور الحيوان ، يلزم وجود مئات أو آلاف أو ملايين أو بلايين أو حتى تريليونات من الانقسامات الخلوية لتشكيل الكائن الحي البالغ. تحدد دورة الخلية ومجموعة الأحداث الخلوية المكونة من G1 (فجوة) و S (تخليق) و G2 (فجوة) و M (الانقسام) سلسلة الأحداث التي يتم تنفيذها في كل انقسام خلية. تعتبر دورة الخلية ديناميكية ويتم تقديرها بشكل أفضل في الوقت الفعلي ، مما قد يكون صعبًا من الناحية الفنية. التقنيات المقدمة في هذا البروتوكول تسمح للمرء بإجراء قياسات لمراحل وتوقيت دورة الخلية من الصور الثابتة.

يعد وضع العلامات باستخدام نظائر النيوكليوزيد مثل 5-ethynyl-2 & # 39-deoxyuridine (EdU) أو 5-bromo-2 & # 39-deoxyuridine (BrdU) هو المعيار الذهبي لتحديد المرحلة S في دراسات ديناميات دورة الخلية في أنواع معينة انيقة (C. ايليجانس) خط جرثومي خنثى بالغ 1، 2، 3، 4، 5. يمكن استخدام كل من EdU و BrdU في أي خلفية وراثية تقريبًا ، حيث لا يعتمدان على أي بنية جينية. يتطلب تصور BrdU معالجة كيميائية قاسية لفضح المستضد لتلطيخ الأجسام المضادة لـ BrdU ، والذي غالبًا ما يكون غير متوافق مع تقييم العلامات الخلوية الأخرى التي يتم تصورها من خلال التلوين المشترك بأجسام مضادة إضافية. على النقيض من ذلك ، يحدث تصور EdU عن طريق النقر فوق الكيمياء في ظل ظروف معتدلة ، وبالتالي فهو متوافق مع التلوين المشترك للأجسام المضادة 6 ، 7.

إن خصوصية الملصق واضحة ، حيث أن النوى لا تتضمن سوى نظائر الثيميدين (5-إيثينيل -2 & # 39- ديوكسيوريدين) في الحمض النووي أثناء المرحلة S. التخيل يحدث في الأنسجة الثابتة. يكون ملصق EdU غير مرئي بحد ذاته حتى تتفاعل الصبغة المحتوية على أزيد أو الفلوروفور بشكل تساهمي مع الألكين في EdU عن طريق كيمياء النقر المحفزة بالنحاس 8. يمكن أن يوفر تصنيف EdU معلومات فورية حول النوى الموجودة في المرحلة S ، باستخدام نبضة قصيرة من وضع العلامات. يمكن أن يوفر EdU أيضًا معلومات ديناميكية ، باستخدام مطاردة النبض أو وضع العلامات المستمرة على سبيل المثال ، في تجربة مطاردة النبض ، يتم تخفيف الملصق عند كل انقسام خلية أو يتم نشره مع تقدم الخلايا غير المنقسمة من خلال التطور.

ال C. ايليجانس خط جرثومة خنثى هو نظام نموذجي قوي لدراسات مسارات الإشارات ، والخلايا الجذعية ، والانقسام الاختزالي ، ودورة الخلية. السلالة الجرثومية البالغة عبارة عن خط تجميع مستقطب مع الخلايا الجذعية الموجودة في الطرف البعيد متبوعًا بالدخول والتقدم من خلال الطور الانتصافي الأولي ، بالتنسيق مع مراحل تكوين الأمشاج بشكل أقرب (شكل 1). في النهاية القريبة ، تنضج البويضات وتخصب وتبدأ في تكوين الجنين في الرحم 9 ، 10 ، 11. ال

20 منطقة طويلة بقطر خلية بالقرب من خلية الطرف البعيدة ، والتي تشمل جذع السلالة الجرثومية الدورية الانقسامية والخلايا السلفية وخلايا الطور S الانتصافي ولكن ليس الخلايا في الطور الانتصافي الأولي ، تسمى منطقة السلف 2 ، 4 ، 9 ، 12. توفر أغشية الخلايا فصلًا غير كامل بين النوى في الخط الجرثومي البعيد ، لكن خلايا المنطقة السلفية تخضع لدورة الخلايا الانقسامية بشكل مستقل إلى حد كبير. متوسط ​​مدة دورة الخلية الانقسامية لخلايا منطقة السلالة الجرثومية في الخنثى الشباب البالغين هو

6.5 ساعات المرحلة G1 قصيرة أو غائبة ، ولا يلاحظ الهدوء 1 ، 2 ، 13. يحدث تمايز الخلايا الجذعية للخط الجرثومي من خلال التمايز المباشر بشكل أساسي ، وبالتالي يفتقر إلى تقسيمات تضخيم العبور 4. أثناء التمايز في مرحلة pachytene ، لن تشكل 4 نوى من أصل 5 بويضات ولكنها ستخضع للاستماتة بدلاً من ذلك ، وتعمل كخلايا ممرضة عن طريق التبرع بمحتوياتها السيتوبلازمية إلى البويضة النامية 12 ، 14 ، 15.

بالإضافة إلى وضع العلامات على الخلايا في المرحلة S مع نظائرها من النيوكليوزيد ، يمكن للمرء تحديد الخلايا في الانقسام والانقسام الاختزالي باستخدام تلطيخ الأجسام المضادة. النوى في الانقسام الفتيلي هي مناعة للأجسام المضادة H3 (Ser10) المضادة للفوسفو هيستون (تسمى pH3) 7 ، 16. النوى في الانقسام الاختزالي هي مناعة للأجسام المضادة لـ HIM-3 (بروتين محور الكروموسوم الانتصافي) 17. يمكن تحديد النوى في منطقة السلف من خلال عدم وجود HIM-3 ، أو وجود Nucleoplasmic REC-8 18 ، أو وجود WAPL-1 19. تكون شدة WAPL-1 أعلى في الغدد التناسلية الجسدية ، وعالية في منطقة السلف ، ومنخفضة خلال نبوءات الانتصافي المبكرة 19. من الممكن إجراء العديد من قياسات دورة الخلية مع بعض الاختلافات في البروتوكول: 1) تحديد النوى في المرحلة S وقياس مؤشر المرحلة S II) تحديد النوى في المرحلة M وقياس مؤشر المرحلة M III) تحديد ما إذا كانت النوى موجودة في الانقسامية أو الانتصافية S- المرحلة الرابعة) قياس مدة G2 V) قياس الثنائي & # 160 من G2 + M + G1 مراحل VI) قياس معدل الدخول الانتصافي السابع) تقدير معدل التقدم الانتصافي.

يمكن للمرء إجراء قياسات متعددة لدورة الخلية من أنواع قليلة فقط من تجارب المعمل الرطب. يصف البروتوكول أدناه وضع العلامات على النبض لمدة 30 دقيقة عن طريق التغذية C. ايليجانس الخنثى البالغات مع البكتيريا المسمى EdU وخلايا الطور M المشترك عن طريق تلطيخ الجسم المضاد لـ pH3 وخلايا المنطقة السلفية عن طريق تلطيخ الجسم المضاد لـ WAPL-1. مطلوب فقط التغييرات في مدة & # 160 من تغذية EdU (الخطوة 2.5) ونوع الأجسام المضادة المستخدمة (الخطوة 5) والتحليلات (الخطوة 8.3) للقياسات الإضافية.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

بروتوكول

1. إعداد البكتيريا المسمى EdU

  1. تنمو ثقافة بداية MG1693. الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية) MG1693 يحمل طفرة في ثايا.
    1. خط خارج بكتريا قولونية MG1693 من مخزون الجلسرين المجمد في طبق بتري أجار ليسوجيني مرق 120 مم. الثقافة في 37 & # 176C بين عشية وضحاها.
    2. تلقيح من شخصين بكتريا قولونية مستعمرات MG1693 في أنبوبين مكررين 4 مل من السائل LB. الثقافة في 37 & # 176C ل

    1. الأوتوكلاف دورق مخروطي سعة 500 مل.
    2. استخدم تقنية معقمة لإضافة 5 مل من 20٪ جلوكوز ، 50 & # 956 لتر من 10 مجم / مل من الثيامين ، 120 & # 956 لتر من 5 ملي ثيميدين ، 100 & # 956 لتر من 1 M MgSO4، 200 & # 956 لتر من 10 ملي مولار ، 100 مل من المخزن المؤقت M9 ، و 4 مل من ثقافة MG1693 المزروعة حديثًا بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: التركيز النهائي لـ EdU هو 20 & # 956M في هذه الثقافة 1 ، 7. يؤدي هذا التركيز إلى تلف الحمض النووي وتوقف دورة الخلية إذا تم تطبيقه مباشرة على خلايا الثدييات في المزرعة 20. ومع ذلك ، يتم دمج جزء صغير فقط من EdU في ملف بكتريا قولونية وبالتالي متاحة ل C. ايليجانس. لا يوجد دليل على توقف دورة الخلية ولا تغيير في حجم منطقة السلف أو مؤشر الطور M بعد علاج EdU للمخنثين الشباب.
    3. الثقافة بين عشية وضحاها ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.

    8 قطرات من المسمى EdU المعلق بكتريا قولونية MG1693 إلى وسط درجة حرارة الغرفة 60 مم M9 أطباق أجار بيتري. دفعة واحدة تنتج

    2. تغذية EdU إلى C. ايليجانس

    1. قم بمزامنة السكان عن طريق وضع البيض في الوقت المناسب ، وعلاج الهيبوكلوريت القلوي متبوعًا بالفقس في وسط S مع الكوليسترول ، أو عن طريق اختيار المرحلة المناسبة 21. تنمو الحيوانات إلى المرحلة المرغوبة (هنا ، 24 ساعة بعد L4) على متوسط ​​نمو الديدان الخيطية المصنف مع بكتريا قولونية OP50 عند 20 & # 176 ج.
      ملاحظة: قم بإعداد 50 & # 8211100 حيوانًا لكل تجربة ، حيث قد لا يتم تشريح بعضها جيدًا ، وسيفقد البعض الآخر في عملية الغسيل والنقل.
    2. اسمح لأطباق EdU بالتسخين إلى 20 & # 176 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المطلوبة للتجربة).
    3. اغسل الحيوانات من أطباق NGM باستخدام M9 أو محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) & # 160 في أنبوب 1.5 مل. اسمح للحيوانات بالاستقرار لفترة وجيزة عن طريق الجاذبية أو الدوران القصير في جهاز طرد مركزي.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وغسل الحيوانات 1 & ​​# 82112 مرة

    3. تشريح وتثبيت C. ايليجانس جرملاين

    ملاحظة: هذا البروتوكول للتشريح والتثبيت وتلطيخ الأجسام المضادة C. ايليجانس السلالة الجرثومية خنثى مطابقة تقريبًا لتلك التي نشرتها Gervaise and Arur (2016) 22 ، باستثناء أنه يمكن طرد الأنابيب الزجاجية بسعة 1 مل لتسريع خطوات الغسيل ويمكن استخدام ماصة باستور الزجاجية المسحوبة لإزالة السائل من 1 مل أنابيب زجاجية أكثر فعالية.

      اغسل وتشريح C. ايليجانس خطوط جرثومية.
        السماح للحيوانات لتستقر في الجزء السفلي من طبق تشريح ، دوامة لجمع الحيوانات في المركز ، واستخدام ماصة باستور طويلة لإزالة برنامج تلفزيوني. يغسل 1 & # 82112 مرة مع

        املأ أنبوب الطرد المركزي الزجاجي بالأعلى باستخدام PBSTw لتخفيف الميثانول وترطيب الغدد التناسلية. تدور في جهاز طرد مركزي سريري بسرعة 870 × ز ل

      5 مل من PBSTw ، تدور في جهاز طرد مركزي سريري بسرعة 870 × ز ل

      5. الكشف عن المستضدات مع الأجسام المضادة

      1. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 30٪ مصل في برنامج تلفزيوني. في المثال الحالي ، يتم تخفيف الجسم المضاد لـ WAPL-1 بنسبة 1: 2000 ويتم تخفيف الجسم المضاد المضاد لـ pH3 بنسبة 1: 500. مصل مذاب الطرد المركزي حديثًا لمدة 10 دقائق في ميكروفوج بسرعة 20000 × ز عند 4 & # 176 درجة مئوية لإزالة الجسيمات. استخدم المادة الطافية ، والتي يمكن تخزينها في 4 & # 176 درجة مئوية لعدة أيام. استخدم المصل المناسب لمطابقة الكائن الحي المضيف للأجسام المضادة الثانوية (يُستخدم مصل الماعز هنا). يمكن إضافة خطوة حجب اختيارية قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية.
      2. ضع 100 & # 956L من الجسم المضاد الأولي المخفف على كل أنبوب زجاجي صغير. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
        ملاحظة: تختلف أوقات الحضانة حسب الجسم المضاد. بالنسبة لبعض الأجسام المضادة ، فإن ساعتين في درجة حرارة الغرفة كافية. تعد الحضانات (على سبيل المثال. ، بين عشية وضحاها) ، ولكنها قد تزيد من الخلفية.
      3. املأ الأنابيب إلى الأعلى باستخدام PBSTw وقم بتدويرها لأسفل في جهاز طرد مركزي سريري بسرعة 870 × ز ل

      1 مل من PBSTw. احتضان ل

      1 مل من PBSTw. احتضان ل

      6. قم بتنفيذ EdU Click Reaction لاكتشاف EdU

      ملاحظة: من الممكن إجراء رد فعل النقر فوق EdU قبل خطوات تلطيخ الجسم المضاد (نفذ الخطوة 6 قبل الخطوة 5) ، اعتمادًا على الأجسام المضادة المستخدمة 7. ومع ذلك ، قد تتداخل كواشف النقر مع مستضدات معينة (على سبيل المثال. ، الجسم المضاد REC-8 حساس للتثبيت والنفاذية). ينتج عن الترتيب المقدم هنا تلطيخ الجسم المضاد اللامع باستخدام الأجسام المضادة REC-8 و WAPL-1 و HIM-3 و pH3 و FLAG و CYE-1 المستخدمة ، من بين أشياء أخرى.

      1. قم بإعداد كوكتيل انقر EdU 8 جديدًا عن طريق إضافة ما يلي إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. ترتيب الإضافات مهم. حماية من الضوء والحفاظ على جميع الكواشف على الجليد. هذه الوصفة تكفي لعينة واحدة (100 & # 956 لتر) قم بضرب الوصفة حسب الحاجة.
        1. أضف 2 مل من الماء عالي النقاوة إلى المادة المضافة المخزنة. هذا يجعل 10x عازلة مضافة ، والتي يجب تخفيفها إلى 1x مباشرة قبل الاستخدام.
        2. أضف 8.5 & # 956 لترًا من المخزن المؤقت 10x إلى 76.5 & # 956 لترًا من الماء عالي النقاوة. اخلط جيدا.
        3. أضف 4 & # 956L من 100 ملي CuSO4 (يمكن تسميته بالمكون E). اخلط جيدا.
        4. أضف 0.25 & # 956L من 488 نانومتر صبغة أزيد. يجب إذابته في درجة حرارة الغرفة ، حيث أن مذيبه ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، يكون صلبًا عند 4 & # 176 درجة مئوية. تخلط جيدا وتحمي من الضوء.
        5. امزج 9 & # 956 لترًا من الماء عالي النقاوة مع 1 & # 956L من المادة المضافة المخزنة في غطاء الأنبوب. الماصة من الغطاء لإضافتها إلى الكوكتيل المتبقي ، وتخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل.

        1 مل من PBSTw. احتضان ل

        7. وصمة عار الحمض النووي وإعداد الشرائح

        8. التصوير والتحليل متحد البؤر

        1. قم بتصوير الغدد التناسلية البعيدة باستخدام مجهر فلورسنت متحد البؤر للقرص الدوار ومجهز بمصدر ضوئي عالي الطاقة وأهداف أحادية اللون وكاميرا مجهرية عالية الكفاءة. التقط الصور بمسافة 1 & # 956 م أو تباعد أضيق بين z-stacks. لاحظ قوة الليزر ، والحساسية ، ووقت التعرض لجميع القنوات.
          1. استخدم ما يلي: إثارة خط ليزر 405 نانومتر مع مرشح انبعاث 485 نانومتر (W60) لـ DAPI ، إثارة خط ليزر 488 نانومتر مع مرشح انبعاث 527 نانومتر (W55) لـ EdU ، إثارة خط ليزر 561 نانومتر مع 615 نانومتر (W70) مرشح الانبعاث لـ WAPL-1 ، وإثارة خط ليزر 640 نانومتر مع مرشح انبعاث 705 نانومتر (W90) لدرجة الحموضة 3.
            ملاحظة: ستختلف شدة الإشارة وشدة الخلفية. وبالمثل ، ستختلف أوقات التعرض المطلوبة ، وربما تصل إلى 10 أضعاف.
          1. (الاختلاف الأول) لتحديد النوى في المرحلة S ، قم بإطعام الحيوانات EdU لمدة 30 دقيقة. أي نوى تعرض ملصق EdU هي نوى S-phase. لحساب ، خذ نواة مجموع A و C ، انظر الجدول 1 و الشكل 2.
            ملاحظة: في نبضة EdU لمدة 30 دقيقة في خنثى بالغين من النوع البري ، يتم تمييز جميع نوى EdU بعلامات منطقة السلف 1.
          2. لقياس منطقة السلف ، وصمة عار بعلامة منطقة السلف مثل REC-8 أو الجسم المضاد WAPL-1. يتم تعريف منطقة السلف هنا على أنها جميع نوى السلالة الجرثومية المناعية المناعية REC-8 18 أو WAPL-1. لحساب ، جمع كل نوى WAPL-1 المناعية (A + B + C + D ، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
            ملاحظة: يقوم WAPL-1 أيضًا بتسمية نواة DTC ونواة الغدد التناسلية الجسدية التي لا ينبغي حسابها. من السهل التعرف على النوى الجسدية عن طريق إشارة WAPL-1 شديدة الكثافة ، وموضعها خارج الخط الجرثومي قليلاً ، و & # 8220 فرايد-بيضة & # 8221 مورفولوجيا النوى.
          3. لقياس مؤشر الطور S ، قم بإجراء تجربة EdU لمدة 30 دقيقة وتسمية مشتركة مع الجسم المضاد REC-8 أو WAPL-1. يتم تعريف مؤشر المرحلة S على أنه نسبة منطقة السلف الموجودة في المرحلة S. لحساب ، قم بحساب جميع نوى الطور S ، ثم اقسم على العدد الإجمالي لنوى منطقة السلف (A + C / A + B + C + D ، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
          4. (التباين الثاني) لتحديد النوى في المرحلة M ، وصمة عار مع الجسم المضاد pH3. أي نوى مناعية pH3 هي نوى M-phase. يعمل هذا بغض النظر عن مدة موجز EdU. لحساب ، خذ مجموع نوى A و B ، انظر الجدول 1 و الشكل 2.
            ملاحظة: يقوم WAPL-1 أيضًا بتسمية نواة DTC ونواة الغدد التناسلية الجسدية التي لا ينبغي حسابها. من السهل التعرف على النوى الجسدية عن طريق إشارة WAPL-1 شديدة الكثافة ، وموضعها خارج الخط الجرثومي قليلاً ، و & # 8220 فرايد-بيضة & # 8221 مورفولوجيا النوى.
          5. لقياس مؤشر الطور M ، ضع علامة مشتركة مع الأجسام المضادة pH3 و REC-8 أو WAPL-1. يتم تعريف مؤشر الطور M على أنه نسبة منطقة السلف الموجودة في الطور M. لحساب ، قم بحساب جميع نوى الطور M ، ثم اقسم على العدد الإجمالي لنوى منطقة السلف (A + B / A + B + C + D ، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
          6. (التباين الثالث) النوى في الطور الانقسامي والانقسام الاختزالي على حد سواء مع EdU. لتمييز المجموعتين عن بعضهما البعض ، حدد ما إذا كانت المرحلة S قد أعقبها الانقسام أو الانقسام الاختزالي. لتحديد ما إذا كانت النوى في مرحلة S الانقسامية أو الانقسام الاختزالي ، قم بتغذية EdU لمدة 4 ساعات والتسمية المشتركة لـ pH3 (علامة M-phase) و HIM-3 (بروتين محور كروموسوم الانقسام الاختزالي) عن طريق تلطيخ الجسم المضاد. سجل النوى التي تعرض كلاً من EdU و pH3 (النوع A ، انظر الجدول 1 و الشكل 2) كطور S انقسامي أثناء النوى التي تعرض كلاً من EdU و HIM-3 (النوع E ، انظر الجدول 1 و الشكل 2) كمرحلة انتصافية S.
          7. (البديل الرابع) احسب مدة المرحلة G2.
            ملاحظة: G2- المرحلة تفصل S- المرحلة من M- المرحلة. على الرغم من عدم الإبلاغ عن أي علامة لتسمية G2 في ملف C. ايليجانس السلالة الجرثومية ، يمكن للمرء حساب مدة المرحلة G2 من خلال الجمع بين البيانات من العديد من التجارب التي تسمي المرحلة M (في وقت التشريح) والمرحلة S (بدءًا من عدة ساعات قبل التشريح). أكملت الخلية التي تعرض علامات الطور M و S المرحلة المرحلة G2 أثناء سير التجربة. لم تكن الخلية التي تعرض علامة الطور M فقط وليس علامة المرحلة S في المرحلة S أثناء التجربة.
            1. لحساب مدة الطور G2 ، قم بتغذية EdU لمدة ساعتين وقم بتسمية مشتركة مع الجسم المضاد pH3. افحص فقط النوى التي تحمل الرقم الهيدروجيني pH3 (هذه في المرحلة M في وقت التشريح) لوجود EdU (كانت هذه في المرحلة S خلال ملصق EdU لمدة ساعتين قبل التشريح). احسب جزء نوى الطور M الذي أكمل طور G2 (A / A + B ، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
            2. كرر هذه التجربة بملصق EdU لمدة 3 ساعات ، ومرة ​​أخرى مع تسمية EdU لمدة 4 ساعات (واختيارياً تسمية EdU 5 ساعات). ارسم النسبة المئوية للنواة الموجبة للأس الهيدروجيني 3 التي تكون EdU موجبة على المحور الصادي ومدة تسمية EdU على المحور السيني ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.
            3. احسب المدة المتوسطة لمرحلة G2 عن طريق توصيل النقاط على الرسم البياني وتحديد مكان تقاطع الخط مع 50٪ ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.
            4. احسب المدة القصوى للطور G2 عن طريق توصيل النقاط على الرسم البياني وتحديد مكان تقاطع الخط مع 99٪ ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.
            1. لحساب مدة G2 + M + G1 ، قم بتغذية EdU لمدة ساعتين وتسمية مشتركة باستخدام الجسم المضاد REC-8 أو WAPL-1. تحديد جزء منطقة السلف التي مرت بمرحلة S خلال هذا الوقت (A + C / A + B + C + D ، راجع الجدول 1 و الشكل 2).
            2. كرر هذه التجربة بملصق EdU لمدة 3 ساعات ، ومرة ​​أخرى مع تسمية EdU لمدة 4 ساعات (واختيارياً تسمية EdU 5 ساعات). ارسم النسبة المئوية لنوى REC-8 أو WAPL-1 الموجبة التي تكون EdU موجبة على المحور الصادي ومدة تسمية EdU على المحور السيني ، كما هو موضح في الشكل 3 ب.
            3. احسب المدة القصوى لـ G2 + M + G1 عن طريق توصيل النقاط على الرسم البياني وإيجاد مكان تقاطع الخط مع 99٪ ، كما هو موضح في الشكل 3 ب.
              ملاحظة: من الممكن إجراء التجارب لتحديد مدة G2 و G2 + M + G1 كمجموعة واحدة من تجارب EdU 2 و 3 و 4 و 5 ساعات عن طريق وضع العلامات المشتركة مع كل من الأرانب المضادة لـ WAPL-1 والأجسام المضادة للفأر المضادة للأس الهيدروجيني.
            1. تغذية البكتيريا التي تحمل علامة EdU للحيوانات لمدة 4 ساعات (& # 8220 نبضة & # 8221). انقل الحيوانات إلى بكتيريا OP50 غير المسماة لمدة 48 ساعة (الشراء & # 8220 & # 8221) ، ثم قم بالتشريح والتسمية المشتركة باستخدام علامة منطقة السلف مثل REC-8 أو WAPL-1 (أو علامة طور الانقسام الاختزالي مثل HIM-3 ) اذا رغب.
            2. عند التصوير ، ابحث عن موضع أقرب نواة تحمل علامة EdU. معدل التقدم الانتصافي هو المسافة (بأقطار الخلية من نهاية منطقة السلف) التي تنتقل بواسطة نواة EdU الأكثر قربًا خلال مطاردة 48 ساعة.

            الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

            نتائج الممثل

            نظرًا لأن توليف الحمض النووي مطلوبًا لدمج EdU ، يمكن للمرء أن يستنتج أن النوى التي تحمل علامة EdU خضعت لمرحلة S أثناء النافذة الزمنية لوضع العلامات EdU. يمكن للمرء أن يفسر النوى تلك التسمية في 30 دقيقة تتغذى بالبكتيريا المسمى EdU على أنها نوى في المرحلة S في وقت التشريح. النوى التي تم تصنيفها في تجربة تغذية EdU المستمرة الأطول قد تكون قد تم تصنيفها في وقت مبكر من النافذة الزمنية ومنذ ترك المرحلة S ، أو ربما تم تصنيفها في الجزء الأخير من نافذة EdU الزمنية. تشترك إشارة EdU في الترجمة مع إشارة DAPI. في بعض النوى ، تغطي إشارة EdU جميع الكروموسومات ، بينما في النوى الأخرى يتم ترجمة إشارة EdU إلى 1 & # 82112 نقطة ساطعة (الشكل 4). من المحتمل أن تكون هذه النقاط هي الكروموسوم X ، الذي يتكرر في وقت متأخر من المرحلة S.

            هنا ، تم تغذية الحيوانات بـ EdU بشكل مستمر لمدة 30 دقيقة وتشريحها ، كما هو موضح أعلاه وفي الشكل 5. أحد الأمثلة على تلطيخ EdU الناجح في حيوان بالغ صغير ومثال واحد على تلطيخ EdU غير ناجح في حيوان بالغ أكبر سنًا (انظر أدناه) موضح في الشكل 4. يتم ترجمة إشارة EdU من وضع العلامات لمدة 30 دقيقة إلى ما يقرب من نصف النوى في منطقة السلف (المحددة بواسطة وسم الجسم المضاد WAPL-1 ولكن يتم تقريبها بواسطة مورفولوجيا DAPI 26 ، 27 ، 28). تم الإبلاغ سابقًا عن مؤشر S-phase ، وهو نسبة المنطقة السلفية التي تكون إيجابية EdU ، عند 57 & # 1775 ٪ وتصل إلى 70 ٪ في الشباب 1 ، 2 ، 3. مؤشر الطور M هو تقريبًا 2 & # 82113٪ 1 ، 29. في التغذية المستمرة لمدة 4 ساعات أو أكثر ، دخلت جميع النوى في تسمية منطقة السلف مع EdU ، وبعض النوى التي تم تصنيفها في منطقة السلف ، منذ ذلك الحين ، المرحلة الأولى 1.

            في حين أن هذه التقنية تعمل باستمرار في الحيوانات البالغة من النوع البري ، إلا أن جزءًا كبيرًا من الخنثى البالغة من العمر 5 أيام (حتى تلك التي تحتوي على الحيوانات المنوية) فشلت في تصنيفها في 30 دقيقة من نبض EdU (الشكل 4E). ومع ذلك ، مع تغذية 4 ساعات EdU ، يتم تسمية جميع هذه الحيوانات تقريبًا. تم الإبلاغ أيضًا عن فشل متقطع في التصنيف في إناث الحيوانات ذات النبضات القصيرة من EdU. قد تكون هناك مواقف أخرى تؤدي إلى فشل متقطع في التسمية.

            يمكن للمرء حساب مدة دورة الخلية عن طريق إجراء العديد من تجارب وضع العلامات EdU مع وضع العلامات على الرقم الهيدروجيني 3 في كل منها. تم تقدير مدة G2 من خلال تحليل نسبة النوى في الطور M (pH3 المناعي) التي كانت إيجابية EdU خلال الدورة الزمنية (الشكل 6). يعطي هذا النهج متوسط ​​وأقصى مدة G2 (الشكل 3 أ). تم استيفاء متوسط ​​الوقت ، مما يدل على أن مدة G2 تقريبية تبلغ 2.5 ساعة في المخنثين الشباب. تم تقدير مدة G2 + M + G1 من النسبة المئوية لجميع نوى منطقة السلف (WAPL-1 المناعي) التي كانت إيجابية EdU (الشكل 6). توفر طريقة G2 + M + G1 أقصى قياس للمدة للمراحل المدمجة (الشكل 3 ب). تم استيفاء الوقت المئوي 99 ، مما يدل على أن مدة G2 + M + G1 تقريبية تبلغ 3.4 ساعة في المخنثين الشباب. تم استخدام البيانات من نفس التجارب لحساب معدل الدخول الانتصافي (نوى لكل ساعة). المعدل هو منحدر الانحدار الخطي لعدد النوى التي دخلت الانقسام الاختزالي (EdU إيجابي ، WAPL-1 سلبي أو HIM-3 إيجابي) خلال مدة تسمية EdU (الشكل 3 ج). يتم عرض قيم المخنثين البالغين من النوع البري البالغ من العمر يوم واحد في الجدول 2.


            الشكل 1: مخطط C. ايليجانس دورة الخط الجرثومي والخلوي. (أ) دورة الخلية للخلايا الجرثومية في السلالة الجرثومية للرجل الشاب خنثى. تشير الأرقام إلى النسبة المئوية التقريبية للوقت المنقضي في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. (ب) C. ايليجانس الخنثى لها خطان جرثوميان على شكل حرف U (أحمر وأزرق). تظهر الحيوانات المنوية باللون الأصفر والرحم مع الأجنة النامية يظهر باللون الرمادي الداكن. يشير الخط البرتقالي المتقطع إلى مكان تشريح الحيوانات لبثق الخطوط الجرثومية. (ج) رسم تخطيطي لتكشف C. ايليجانس خط جرثومي. DAPI (أزرق) هي صبغة DNA تسلط الضوء على التشكل النووي. تحتوي منطقة السلف البعيدة (المظللة باللون الأحمر على أساس تلطيخ الأجسام المضادة WAPL-1) على خلايا جذعية متدرجة ، وخلايا سلف ، وخلايا في الطور S الانتصافي (يصف WAPL-1 أيضًا نوى الغدد التناسلية الجسدية). الخلايا في ملصق طور S الانقسامي والانقسام الاختزالي بنبض EdU لمدة 30 دقيقة ومشار إليها باللون الأخضر. خليتان في ملصق الطور M مع الجسم المضاد pH3 وتظهر باللون الأسود. توفر خلية الطرف البعيد (DTC) رابط GLP-1 / Notch للحفاظ على مصير الخلايا الجذعية لهذه الخلايا. عندما تهاجر الخلايا بعيدًا عن DTC ، فإنها تخرج من منطقة السلف وتدخل في طور الانقسام الاختزالي.الخلايا الصفراء هي الحيوانات المنوية في الحيوانات المنوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


            الشكل 2: مخطط فين لفئات النوى. يتم تجميع النوى حسب وجود وغياب ثلاث علامات: يشير WAPL-1 إلى خلايا منطقة السلف (أحمر) ، ويشير EdU إلى خلايا المرحلة S (أخضر) ، ويشير الرقم الهيدروجيني 3 إلى خلايا M-phase (أزرق). يتم تحديد أنواع الخلايا على أنها اي جي. لاحظ أنه في النوع البري لم يتم العثور على خلايا خنثى من النوع F ، ولا تشارك الخلايا مع EdU و pH3 خارج منطقة السلف (WAPL-1 الإيجابي). يشير مخطط الغدد التناسلية البعيدة أدناه إلى مثال واحد لنواة A-E و G. ارى الجدول 1 لمزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


            الشكل 3: عرض رسومي لمدة دورة الخلية ومعدل البيانات التجريبية دخول الانقسام الاختزالي. (أ) يتم استيفاء مدة الطور G2 من وضع العلامات المشترك لـ pH3 و EdU بعد فترات متفاوتة من نبضات EdU. تشير الخطوط الرمادية إلى النسب المئوية الخمسين والتاسعة والتسعين المستخدمة في متوسط ​​الاستيفاء ومدد G2 القصوى ، المشار إليها بواسطة الأسهم. (ب) لا تتضمن الخلية في طور G2 أو M أو G1 EdU. وبالتالي ، يمكن تقدير الحد الأقصى لمدة طور G2 + M + G1 عن طريق قياس المدة القصوى لتسمية EdU التي تنتج خلايا EdU سلبية. مدة الطور G2 + M + G1 مستوفاة من EdU و REC-8 المشترك بعد نبضات EdU متغيرة المدة. يشير الخط الرمادي إلى النسبة المئوية 99 المستخدمة في استكمال الحد الأقصى لمدة G2 + M + G1 ، المشار إليها بواسطة سهم. لا يمكن استيفاء متوسط ​​مدة G2 + M + G1. (ج) معدل الدخول الانتصافي (في النواة لكل ساعة & # 8211 انظر الجدول 2) من منحدر خط الانحدار. لاحظ أنه نظرًا لأن تقاطع y ليس صفراً ، فإن الانحدار ضروري لإجراء حساب دقيق لمعدل الدخول الانتصافي (C). . تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. تم تعديل الأرقام وطبعها بإذن من فوكس وآخرون. 2011 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


            الشكل 4: مثال على تلطيخ EdU لمدة 30 دقيقة ناجحًا وغير ناجح. صور مجهر متحد البؤر لطفل عمره يوم واحد (ميلادي) وعمره 5 أيام (E-H) الغدد التناسلية خنثى (لا تستنفد الحيوانات المنوية) بعد تجربة توسيم EdU لمدة 30 دقيقة. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى نهاية منطقة السلف. تشير علامة النجمة إلى موضع الطرف البعيد. علامات خضراء تلطيخ EdU تصور عن طريق النقر فوق الكيمياء (أ). يؤدي تصنيف EdU غير الناجح إلى تلطيخ الخلفية بمستوى منخفض ولكن لا توجد نوى EdU + ساطعة (ه). علامات حمراء WAPL-1 المناعي (ب ، واو). يشير اللون الأصفر إلى التداخل (سي ، جي). علامات زرقاء تلطيخ DAPI للحمض النووي (د ، ح). تشير رؤوس الأسهم الفردية إلى نواة مع تلطيخ EdU في جميع أنحاء الكروماتين. تشير رؤوس الأسهم المزدوجة إلى نواة بها EdU puncta على زوج واحد فقط من الكروموسومات. تم الحصول على الصور بهدف 63X. شريط المقياس = 10 & # 181 م & # 160 (د ، ح). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


            الشكل 5: سير العمل التجريبي. ملخص للبروتوكول التجريبي للنمو (أ) ، تسمية EdU (ب) ، تشريح (ج) ، بقعة الأجسام المضادة (د) ، قم بإجراء رد فعل النقر لإرفاق صبغة بـ EdU (ه) وصمة عار DNA (F) ، خطوط جرثومية للصورة (جي) ، وتحديد النوى المصبوغة بالأجسام المضادة والتي تحمل علامة EdU (ح). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


            الشكل 6: مثال على تلطيخ EdU لمدة 4 ساعات. صور مجهر متحد البؤر لمناسل خنثى بالغ يبلغ من العمر يوم واحد بعد تجربة وضع العلامات EdU لمدة 4 ساعات. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى نهاية منطقة السلف. تشير علامة النجمة إلى موضع الطرف البعيد. أرجواني علامات التألق المناعي pH3 (أ ، ج). علامات خضراء تلطيخ EdU تصور عن طريق النقر فوق الكيمياء (قبل الميلاد). علامات حمراء WAPL-1 المناعي (د). يشير اللون الأصفر إلى تداخل EdU و WAPL-1 (ه). علامات زرقاء تلطيخ DAPI للحمض النووي (F). تشير رؤوس الأسهم المفردة إلى نوى مشتركة مع EdU و pH3. يشير رأس السهم المزدوج إلى pH3 + EdU- نواة - وهو أمر نادر الحدوث في تصنيف EdU لمدة 4 ساعات. الأسهم علامة EdU + WAPL-1 - النوى التي دخلت الانقسام الاختزالي. تم الحصول على الصور بهدف 63X. يظهر شريط مقياس 10 & # 181 م (F). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

            علامة: الرقم الهيدروجيني 3 EdU * WAPL-1 أو REC-8 HIM-3
            ترجمة: الانقسام المتساوي S- المرحلة * منطقة السلف الانقسام الاختزالي
            فصل: الجمع بين التفسير:
            أ في M-phase ، في منطقة السلف ، كانت في مرحلة S الانقسامية أثناء تسمية EdU (مكتمل G2)
            ب في M-phase ، في منطقة السلف ، لم تكن في المرحلة S أثناء تسمية EdU
            ج في الطور البيني ، في منطقة السلف ، كانت في المرحلة S أثناء تسمية EdU
            د في الطور البيني ، في منطقة السلف ، لم تكن في المرحلة S أثناء تسمية EdU
            ه في الانقسام الاختزالي ، كانت في الطور S الانتصافي أثناء تسمية EdU (نوى دخول الانقسام الاختزالي)
            F العودة إلى الانقسام (الموجود في بعض المسوخات) أو الانقسامات الانتصافية (في تكوين الحيوانات المنوية)
            جي في الانقسام الاختزالي ، لم تكن في المرحلة S أثناء تسمية EdU
            مجموع مجموع الرقم الهيدروجيني 3 إيجابي جميع الخلايا في المرحلة M. مجموع إجمالي EdU إيجابي جميع الخلايا في المرحلة S. مجموع إجمالي WAPL-1 إيجابي & # 160 جميع الخلايا في منطقة السلف مجموع إجمالي HIM-3 إيجابي لجميع الخلايا في الطور الانتصافي

            الجدول 1: أصناف النوى. * لاحظ أن تجارب EdU لمدة 30 دقيقة و 4 ساعات تختلف في التفسير. في تجارب EdU ذات المدة الأطول ، من المحتمل أن تكون الخلايا قد تقدمت إلى ما بعد المرحلة S. انظر المقدمة و الخطوة 8 لمدة تصنيف EdU للتجربة ذات الصلة.

            جزء دورة الخلية التعريف التشغيلي عملية حسابية* قيمة**
            نوى منطقة السلف جميع النوى WAPL-1 (أو REC-8) الإيجابية والسلبية HIM-3 أ + ب + ج + د 231 & # 177 23 نواة
            نوى S- المرحلة النواة إيجابية EdU بعد 30 دقيقة من تسمية EdU و WAPL-1 إيجابية أ + ج 133 & # 177 20 نواة
            نوى M- المرحلة نواة إيجابية مشتركة pH3 و WAPL-1 أ + ب 5.2 & # 177 2.3 نوى
            مؤشر S- المرحلة نوى على شكل S / نوى منطقة السلف أ + ج / أ + ب + ج + د 57٪ من دورة الخلية
            مؤشر M- المرحلة نوى M-phase / نوى منطقة السلف أ + ب / أ + ب + ج + د 2٪ من دورة الخلية
            خلايا الدخول الانتصافية وصف EdU النوى في الانقسام الاختزالي ه يختلف حسب مدة تسمية EdU
            معدل الدخول Meiotic نوى دخول Meiotic لكل ساعة من تسمية EdU منحدر من الشكل 4C *** 20.3 نواة لكل ساعة
            مدة G2 (متوسط) 50٪ اعتراض من الشكل 4 أ 2.5 ساعات
            مدة G2 (الحد الأقصى) 99٪ اعتراض من الشكل 4 أ 3.5 ساعات
            مدة G2 + M + G1 (الحد الأقصى) 99٪ اعتراض من الشكل 4 ب 3.5 ساعات
            مدة دورة الخلية (متوسط) متوسط ​​مدة G2 / مؤشر G2 **** 6.5 ساعات
            مدة دورة الخلية (الحد الأقصى) مدة G2 القصوى / مؤشر G2 **** 8.1 ساعات

            الجدول 2: حسابات دورة الخلية. * تمثل الحروف فئات النوى المحددة في الجدول 1 و الشكل 3. تم تعديل الحسابات من Fox وآخرون. 2011 1. ** القيم (& # 177 الانحراف المعياري) للخنثى من النوع البري التي تم رفعها عند 20 درجة مئوية و 176 درجة مئوية حتى 24 ساعة بعد منتصف المرحلة الرابعة. *** لاحظ أنه نظرًا لأن تقاطع y ليس صفراً ، فإن الانحدار ضروري لحساب دقيق لمعدل الدخول الانتصافي. **** يتم تحديد مؤشر G2 عن طريق طرح مؤشر المرحلة S ، ومؤشر الطور M ، ومؤشر G1 التقريبي (2٪) من 100٪ ، كما وصفه Fox et al. 2011 1.

            الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

            مناقشة

            يعد إعداد البكتيريا التي تحمل علامة EdU (الخطوة 1) أمرًا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول ، والنقطة الأولى لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ملصق خنثى بالغين من النوع البري بشكل موثوق للغاية في نبض EdU لمدة 4 ساعات ، مما يجعل هذا أداة تحكم مفيدة لكل دفعة جديدة من البكتيريا التي تحمل علامة EdU. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البكتيريا السليمة التي تحمل علامة EdU والتي تدخل الأمعاء (في الحيوانات الأكبر سنًا أو بعض المسوخات المعيبة في البلعوم / المطحنة) سوف يتم تصنيفها باستخدام كيمياء النقر وتظهر على شكل نقاط نقطية مستطيلة الشكل في القناة الهضمية. تستخدم تقنية بديلة لوضع العلامات على الخنثى a & # 8220soak & # 8221 بتركيز عالٍ (1 ملم) من EdU 3. تعمل هذه التقنية على تجويع الحيوانات طوال مدة وضع العلامات ، ولكنها توفر طريقة مفيدة لتجاوز تكوين البكتيريا التي تحمل علامة EdU عند استكشاف أخطاء التثبيت وإصلاحها والنقر فوق الكيمياء. إذا كانت تجربة EdU & # 8220soak & # 8221 ناجحة بينما لم تكن تغذية EdU ، فقم بإعداد بكتيريا جديدة تحمل علامة EdU. للوصول إلى كثافة بكتيرية كافية مع تحقيق محتوى عالي من EdU ، قد يحتاج المرء إلى ضبط تركيزات EdU و thymidine.

            يتمثل القيد الرئيسي لهذه التقنية في وضع العلامات على المرحلة S في الحاجة إلى تغذية البكتيريا التي تحمل علامة EdU للحيوانات. قد لا يتم تصنيف الحيوانات التي لا يمكنها إطعامها (بسبب التركيب الوراثي أو المرحلة) باستخدام هذه التقنية. ومع ذلك ، فإن نظائر النيوكليوزيد هي حاليًا الطريقة الوحيدة لتحديد نوى المرحلة S في C. ايليجانس السلالة الجرثومية ، ولا يتطلب استخدامها وجود أي جينات منقولة في الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد دمجها ، تظل EdU في النوى حتى أثناء خروجها من المرحلة S ، أو التقدم خلال دورة الخلية ، أو الانقسام ، أو التمايز. تضعف الإشارة بمقدار النصف مع كل انقسام للخلية. هذا يجعل EdU مثاليًا لتتبع سجل الخلية & # 8217s حتى من خلال عدد قليل من انقسامات الخلايا.

            يجعل استقرار EdU تجارب مطاردة النبض مباشرة ببساطة شطف بكتيريا EdU الزائدة من الحيوانات بعد انتهاء المدة المطلوبة للنبض ونقل الحيوانات إلى بكتيريا غير مسماة. يظل EdU في الحمض النووي ويظل مرئيًا حتى بعد الانقسامات الخلوية المتعددة. ومع ذلك ، تقتصر التجارب على نوع واحد من تسمية المرحلة S (نبضة واحدة من EdU). يمكن وضع العلامات المشتركة مع EdU و BrdU في خلايا الثدييات 31 ولكن لم يتم الإبلاغ عنها في C. ايليجانس. يتم استخدام العلامات المشتركة لـ IdU و CldU في الثدييات 32 ولكن لم يتم الإبلاغ عنها أيضًا في C. ايليجانس.

            تتمثل المزايا الرئيسية لتوسيم EdU في أن الطريقة لا تتطلب أي جينات محورة ، ويمكن تغذية EdU بها C. ايليجانس خلال الزراعة العادية ، تتوافق الكيمياء مع تقنيات الفلورسنت المناعي ، ويستمر EdU في الحمض النووي لفترة طويلة بعد توقف التغذية. تجعل هذه الميزات EdU أداة رائعة لدراسة العديد من جوانب دورة الخلية وديناميكيات الخلية الجرثومية.

            يمكن تطبيق تحليل دورة الخلية وديناميات الخلية الجرثومية باستخدام EdU على مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية. مجرد أمثلة قليلة على المزيد من التطبيقات لهذه الطريقة: كيف تتغير ديناميكيات دورة الخلية في الحيوانات ذات الطفرات الجينية لدورة الخلية؟ كيف تؤثر الظروف الفسيولوجية على دورة الخلية في الخلايا الجذعية ، ومعدل دخول الخلية الجرثومية في الطور الانتصافي ، ومعدل تقدم الخلايا الجرثومية خلال الطور الانقباضي؟ كيف تتغير دورة الخلية أثناء تطور اليرقات؟ كيف تؤثر اضطرابات مسار الإشارات الرئيسية على دورة الخلية ، بالإضافة إلى التغيرات في مصير الخلية (مثل الانتشار خارج الرحم)؟ يمكن تعديل هذا النظام لدراسة ما تفعله الخلايا في العديد من الظروف المختلفة.

            الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

            الإفصاحات

            الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

            شكر وتقدير

            نحن ممتنون ل بكتريا قولونية مركز الأسهم لـ MG1693 Wormbase the التهاب الكينورهاب مركز علم الوراثة الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40OD010440) للسلالات Zach Pincus للحصول على المشورة الإحصائية Aiping Feng للكواشف Luke Schneider و Andrea Scharf و Sandeep Kumar و John Brenner للتدريب والمشورة والدعم و مناقشة مفيدة ومختبرات Kornfeld و Schedl للتعليق على هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيًا بواسطة المعاهد الوطنية للصحة [R01 AG02656106A1 إلى KK ، R01 GM100756 إلى TS] والزمالة ما قبل الدكتوراه لمؤسسة العلوم الوطنية [DGE-1143954 و DGE-1745038 إلى ZK]. لم يكن للمعاهد الوطنية للصحة ولا المؤسسة الوطنية للعلوم أي دور في تصميم الدراسة ، وجمع ، وتحليل ، وتفسير البيانات ، ولا في كتابة المخطوطة.


            المواد التكميلية الإلكترونية متاحة على الإنترنت على https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4369613.

            تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

            مراجع

            . 2015 ما بعد "جدل مندل فيشر". علم 350، 159-160. (دوى: 10.1126 / science.aab3846) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            أنافا إس ، بوسنر آر ، ريكافي أو

            . 2014 الوراثة اللاجينية عبر الأجيال: الأساطير والآليات. زنزانة 157، 95-109. (دوى: 10.1016 / j.cell.2014.02.045) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2017 مبادئ وراثة الحمض النووي الريبي الصغير عبر الأجيال في أنواع معينة انيقة . بالعملة. بيول. 27، R720-R730. (دوى: 10.1016 / j.cub.2017.05.043) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Rechavi O ، Minevich G ، Hobert O

            . 2011 الوراثة عبر الأجيال لاستجابة صغيرة مكتسبة من الحمض النووي الريبي المضادة للفيروسات في C. ايليجانس . زنزانة 147، ١٢٤٨-١٢٥٦. (دوى: 10.1016 / j.cell.2011.10.042) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Gammon DB و Ishidate T و Li L و Gu W و Silverman N و Mello CC

            . 2017 توفر استجابة تداخل الحمض النووي الريبي المضاد للفيروسات مقاومة لعدوى الفيروسات القاتلة والانتقال العمودي في أنواع معينة انيقة . بالعملة. بيول. 27، 795-806. (دوى: 10.1016 / j.cub.2017.02.004) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2012 إسكات الجينات المضيفة الموجهة بواسطة رنا قصير التداخل مشتق من الفيروسات في أنواع معينة انيقة . J. فيرول. 86، 11 645-11 653. (دوى: 10.1128 / JVI.01501-12) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

            Rechavi O ، و Houri-Ze'evi L ، و Anava S ، و Goh WSS ، و Kerk SY ، و Hannon GJ ، و Hobert O

            . 2014 الميراث عبر الأجيال الناجم عن الجوع من الحمض النووي الريبي الصغير في C. ايليجانس . زنزانة 158، 277-287. (دوى: 10.1016 / j.cell.2014.06.020) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Jobson MA ، Jordan JM ، Sandrof MA ، Hibshman JD ، Ashley L ، Baugh LR

            . 2015 الآثار العابرة للأجيال للمجاعة المبكرة في الحياة على النمو والتكاثر ومقاومة الإجهاد في C. ايليجانس . علم الوراثة 201، 1-37. (دوى: 10.1534 / genetics.115.178699) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2017 AMPK يحجب العيوب العابرة للأجيال التي تسبب المجاعة في أنواع معينة انيقة . بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114، E2689-E2698. (دوى: 10.1073 / pnas.1616171114) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            ويبستر إيه كيه ، جوردان جي إم ، هيبشمان دينار ، شيتراكار آر ، بوغ إل آر

            . 2018 التأثيرات العابرة للأجيال لنوم داور الممتد على بقاء الجوع ودونة التعبير الجيني في أنواع معينة انيقة . علم الوراثة 210، 263-274. (دوى: 10.1534 / genetics.118.301250) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            كلوسين أ ، كاساس إي ، هيدالجو-كارسيدو سي ، فافوري تي ، لينر ب

            . 2017 انتقال المعلومات البيئية عبر الأجيال في C. ايليجانس . علم 356، 320-323. (دوى: 10.1126 / science.aah6412) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            شوت د ، ياناي الأول ، هانتر سي بي

            . 2014 تداخل الحمض النووي الريبي الطبيعي يوجه استجابة موروثة للبيئة. علوم. اعادة عد. 4، 7387. (doi: 10.1038 / srep07387) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

            Ni JZ ، Kalinava N ، Chen E ، Huang A ، Trinh T ، Gu SG

            . 2016 دور عبر الأجيال لمسار RNAi النووي للخطوط الجرثومية في قمع تنشيط النسخ الناتج عن الإجهاد الحراري في C. ايليجانس . إبيجينيت. الكروماتينية 9، 3. (دوى: 10.1186 / s13072-016-0052-x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            كيشيموتو إس ، أونو إم ، أوكابي إي ، نونو إم ، نيشيدا إي

            . تحث الضغوط البيئية لعام 2017 على مزايا البقاء المتوارثة عبر الأجيال عبر التواصل بين السلالة الجنسية في أنواع معينة انيقة . نات. كومون. 8، 14031. (doi: 10.1038 / ncomms14031) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

            بيرتون لا ، فوروتا تي ، ويبستر إيه كيه ، كابلان ري ، بو إل آر ، آرور إس ، هورفيتز إتش آر

            . 2017 إشارات تشبه الأنسولين إلى السلالة الجرثومية للأم تتحكم في استجابة ذرية للإجهاد التناضحي. نات. خلية بيول. 19، 252. (doi: 10.1038 / ncb3470) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

            Tauffenberger A ، باركر جا

            . 2014 انتقال وراثي لمقاومة الإجهاد عن طريق ارتفاع الجلوكوز الغذائي في أنواع معينة انيقة . بلوس جينيت. 10، e1004346. (دوى: 10.1371 / journal.pgen.1004346) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            سزيوتشيك نيوجيرسي ، كوزاك إي ، كونلي كاليفورنيا

            . 2003 وسيط محدد كيميائيا و أنواع معينة انيقة . BMC Biotechnol. 3، 19. (دوى: 10.1186 / 1472-6750-3-19) Crossref ، PubMed ، ISI ، Google Scholar

            Laranjeiro R، Harinath G، Burke D، Braeckman BP، Driscoll M

            . 2017 جلسات سباحة فردية في C. ايليجانس حمل السمات الرئيسية لممارسة الثدييات. بيول بيول. 15، 30. (دوى: 10.1186 / s12915-017-0368-4) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2000 إمراضية وتطور وتكاثر التهاب الجراثيم المتغاير الجرثومية و Steinernema carpocapsae تحت ظروف ممرضة في الجسم الحي. J. اللافتري. باتول. 75، 55-58. (دوى: 10.1006 / jipa.1999.4900) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            بيترز أ ، هان آر ، يان إكس ، لايت إل جي

            . 2017 إنتاج الديدان الخيطية الممرضة للحشرات. في المكافحة الميكروبية للآفات الحشرية والعثية (محرر ل.لاسي) ، ص 157-170. لندن ، المملكة المتحدة: مطبعة أكاديمية. كروسريف ، الباحث العلمي من Google

            . 1996 استزراع سائل على نطاق تجريبي وحصاد نيماتودا ممرضة للحشرات ، Heterorhabditis bacteriophora . J. اللافتري. باتول. 67، 92-99. (دوى: 10.1006 / jipa.1996.0013) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

            Upadhyay D ، Mandjiny S ، Bullard-Dillard R ، Storms M ، Menefee M ، Holmes LD

            . 2015 Lab-scale في المختبر الإنتاج الضخم للنيماتودا الممرضة للحشرات Heterorhabditis bacteriophora باستخدام تقنية تخمير الثقافة السائلة. أكون. J. Biosci. بيونج. 3، 203. (دوى: 10.11648 / j.bio.20150306.19) الباحث العلمي من Google

            Werner MS، Sieriebriennikov B، Loschko T، Namdeo S، Lenuzzi M، Dardiry M، Renahan T، Sharma DR، Sommer RJ

            . 2017 التأثير البيئي على Pristionchus pacificus شكل الفم من خلال طرق الاستزراع المختلفة. علوم. اعادة عد. 7، 7207. (دوى: 10.1038 / s41598-017-07455-7) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2006 علم البيئة التهاب الكينورهاب محيط . WormBook ، 6-7. (دوى: 10.1895 / wormbook.1.37.1) الباحث العلمي من Google

            . 2017 البيئة الحيوية الطبيعية أنواع معينة انيقة . علم الوراثة 206، 55-86. (دوى: 10.1534 / genetics.116.195511) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            2016 فئة وفيرة من الحمض النووي غير المشفر يمكن أن تمنع إسكات الجينات العشوائية في C. ايليجانس خط جرثومي. زنزانة 166، 343-357. (دوى: 10.1016 / j.cell.2016.05.072) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Timmons L ، Tabara H ، Mello CC ، Fire AZ

            . 2003 إسكات الرنا الجهازي المستحث في أنواع معينة انيقة . مول. بيول. زنزانة 14، 2972-2983. (دوى: 10.1091 / mbc.E03-01-0858) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Doh JH ، Moore AB ، Celen I ، Moore MT ، Sabanayagam CR

            . 2016 ChIP والرقائق: تقديم WormPharm للدراسات المترابطة التي تستخدم علم الصيدلة والتحليلات على مستوى الجينوم في C. ايليجانس . J. بيول. أساليب 3، 44. (دوى: 10.14440 / jbm.2016.109) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

            Çelen İ، Doh JH، Sabanayagam CR

            . 2018 تأثير الزراعة السائلة على التعبير الجيني والنمط الظاهري لـ C. ايليجانس . علم الجينوم BMC 19، 562. (دوى: 10.1186 / s12864-018-4948-7) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2011 تعبير Ascaroside في أنواع معينة انيقة يعتمد بشدة على النظام الغذائي ومرحلة النمو. بلوس واحد 6، e17804. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0017804) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            فون رويس إس إتش ، بوز إن ، سرينيفاسان جي ، يم جي جي ، جودكينز جي سي ، ستيرنبرغ بي دبليو ، شرودر إف سي

            . 2012 الأيض المقارن يكشف عن التولد الحيوي للأسكاروزيدات ، مكتبة معيارية لإشارات الجزيئات الصغيرة في C. ايليجانس . جيه. تشيم. شركة 134، 1817-1824. (دوى: 10.1021 / ja210202y) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2017 يزدحم اليرقات يتسارع C. ايليجانس التنمية ويقلل من العمر الافتراضي. بلوس جينيت. 13، e1006717. (دوى: 10.1371 / journal.pgen.1006717) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2008 مزيج من الجزيئات الصغيرة ينظم التزاوج والتطور في أنواع معينة انيقة . طبيعة سجية 454، 1115-1118. (دوى: 10.1038 / nature07168) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 1985 الجين الذي يؤثر على إنتاج الجين أنواع معينة انيقة فرمون يحفز داور. MGG مول. الجنرال جينيه. 198، 534-536. (دوى: 10.1097 / 01.EPX.0000417960.79703.06) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

            ماكغراث بي تي ، شو Y ، Ailion M ، Garrison JL ، Butcher RA ، Bargmann CI

            . 2011 تطور متوازي من المستأنسة التهاب الكينورهاب الأنواع تستهدف جينات مستقبلات الفرمون. طبيعة سجية 477، 321-325. (دوى: 10.1038 / nature10378) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

            . 1977 تغييرات تشريحية عصبية محددة في طفرات الحسية الكيميائية للنيماتودا أنواع معينة انيقة . J. كومب. نيورول. 172، 489-510. (دوى: 10.1002 / cne.901720306) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            بيركنز لوس أنجلوس ، هيدجكوك إم ، طومسون جن ، كولوتي جيه جي

            . 1986 أهداب حسية متحولة في الديدان الخيطية أنواع معينة انيقة . ديف. بيول. 117، 456-487. (دوى: 10.1016 / 0012-1606 (86) 90314-3) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Bargmann CI، Hartwieg E، Horvitz HR

            . 1993 تتوسط الجينات والخلايا العصبية الانتقائية للرائحة في الشم C. ايليجانس . زنزانة 74، 515-527. (دوى: 10.1016 / 0092-8674 (93) 80053-H) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2013 الأنسولين / عامل النمو الشبيه بالأنسولين في C. ايليجانس . WormBook ، 1-43. (دوى: 10.1895 / wormbook.1.164.1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

            بكالوريوس باكلي ، بوركهارت كيلوبايت ، غو إس جي ، سبراكلين جي ، كيرشنر أ ، فريتز إتش ، كيمبل جي ، فاير أ ، كينيدي إس

            . 2012 أرغوناوت نووي يعزز الوراثة اللاجينية متعددة الأجيال وخلود السلالة الجرثومية. طبيعة سجية 489، 447-451. (دوى: 10.1038 / nature11352) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

            Guang S، Bochner AF، Pavelec DM، Burkhart KB، Harding S، Lachowiec J، Kennedy S

            . 2008 Argonaute ينقل siRNAs من السيتوبلازم إلى النواة. علم 321، 537-541. (دوى: 10.1126 / العلوم .1157647) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            بيرتون لا ، بوركهارت كيلوبايت ، كينيدي إس

            . 2011 RNAi النووي يحافظ على إسكات الجينات الوراثية في أنواع معينة انيقة . بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 108، 19683-19688. (دوى: 10.1073 / pnas.1113310108) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

            Sapetschnig A ، Sarkies P ، Lehrbach NJ ، Miska EA

            . 2015 Tertiary siRNAs تتوسط في البارامترات في C. ايليجانس . بلوس جينيت. 11، e1005078. (دوى: 10.1371 / journal.pgen.1005078) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Gu SG، Pak J، Guang S، Maniar JM، Kennedy S، Fire A

            . 2012 تضخيم سيرنا في أنواع معينة انيقة يولد بصمة مثيلة هيستون H3 ليسين 9 تستهدف التسلسل عبر الأجيال. نات. جينيه. 44، 157-164. (دوى: 10.1038 / ng.1039) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

            Lev I ، Gingold H ، Rechavi O

            . في الصحافة. مطلوب H3K9me3 للوراثة عبر الأجيال من RNAs الصغيرة التي تستهدف مجموعة فرعية فريدة من الجينات المتطورة حديثًا. eLife. (دوى: 10.1101 / 338582) الباحث العلمي من Google

            Lev I ، Seroussi U ، Gingold H ، Bril R ، Anava S ، Rechavi O

            . 2017 مثيلة H3K9 المعتمدة على MET-2 تمنع ميراث الحمض النووي الريبي الصغير عبر الأجيال. بالعملة. بيول. 27، 1138-1147. (دوى: 10.1016 / j.cub.2017.03.008) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2017 يتعاون فريق من العوامل المتغايرة الكروماتين مع مسارات الحمض النووي الريبي الصغيرة لمكافحة العناصر المتكررة وإجهاد الخط الجرثومي. eLife 6، e21666. (دوى: 10.7554 / eLife.21666) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Towbin BDD ، González-Aguilera C ، Sack R ، Gaidatzis D ، Kalck V ، Meister P ، Askjaer P ، Gasser SMM

            . 2012 الميثيل التدريجي للهيستون H3K9 يضع الكروماتين المغاير في المحيط النووي. زنزانة 150، 934-947. (دوى: 10.1016 / j.cell.2012.06.051) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Spracklin G ، الحقول B ، Wan G ، Vijayendran D ، Wallig A ، Shukla A ، Kennedy S

            . 2017 تحديد وتوصيف C. ايليجانس آلات الوراثة RNAi. علم الوراثة 206، 1-19. (دوى: 10.20944 / preprints201702.0096.v1) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Hodgkin J، Félix M-A، Clark LC، Stroud D، Gravato-Nobre MJ

            . 2013 اثنان Leucobacter سلالات تمارس ضراوة تكميلية على التهاب الكينورهاب بما في ذلك الموت عن طريق تكوين نجم دودة. بالعملة. بيول. 23، 2157-2161. (دوى: 10.1016 / j.cub.2013.08.060) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Ehlers R-U ، Lunau S ، Krasomil-Osterfeld K ، Osterfeld KH

            . 1998 الثقافة السائلة للديدان الخيطية الممرضة للحشرات - البكتيريا - التهاب Heterorhabditis megidis / Photorhabdus luminescens. BioControl 43، 77-86. (دوى: 10.1023 / A: 1009965922794) Crossref، ISI، Google Scholar

            . 1998 إنتاج إشارة الغذاء Photorhabdus luminescens تحفيز استعادة الديدان الخيطية الممرضة للحشرات Heterorhabditis النيابة. في الثقافة السائلة. تطبيق ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 50، 369-374. (دوى: 10.1007 / s002530051306) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من جوجل

            . 2010 تحقق من ثقافاتك! قائمة بخطوط الخلايا الملوثة أو التي تم التعرف عليها بشكل خاطئ. كثافة العمليات J. السرطان 127، 1-8. (دوى: 10.1002 / ijc.25242) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2018 التطور الجيني والنسخي يغير استجابة خط الخلايا السرطانية للأدوية. طبيعة سجية 560، 325-330. (دوى: 10.1038 / s41586-018-0409-3) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 1998 مزامنة الخلية. طرق خلية بيول. 57، 229-249. (دوى: 10.1016 / S0091-679X (08) 61582-4) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Niida H ، و Matsumoto T ، و Satoh H ، و Shiwa M ، و Tokutake Y ، و Furuichi Y ، و Shinkai Y

            . 1998 خلل شديد في النمو في خلايا الفأر التي تفتقر إلى مكون التيلوميراز RNA. نات. جينيه. 19، 203-206. (دوى: 10.1038 / 580) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

            كامبوس إي ، ستافورد جم ، راينبرغ د

            . 2014 الوراثة اللاجينية: إشارات مرجعية هيستون عبر الأجيال. اتجاهات خلية بيول. 24، 664-674. (دوى: 10.1016 / j.tcb.2014.08.004) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            . 2013 التغيرات الوراثية والتخلقية الناتجة عن زراعة الأنسجة في الخطوط النقية للأرز ، وهجينة F1 ومتعددة الصيغ الصبغية. بيول مصنع بيول. 13، 77. (دوى: 10.1186 / 1471-2229-13-77) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            إم جياليتاكيس ، ف أرامباتزي ، تي ماكاتوناكيس ، ياء باباماتاكيس

            . 2010 ذاكرة النسخ المعتمدة على إنترفيرون غاما عن طريق إعادة تحديد موضع الجين إلى الهيئات النووية PML. مول. زنزانة. بيول. 30، 2046-2056. (دوى: 10.1128 / MCB.00906-09) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

            Light WH و Freaney J و Sood V و Thompson A و D'Urso A و Horvath CM و Brickner JH


            المواد والأساليب

            زراعة C. ايليجانس الديدان

            أنواع معينة انيقة سلالة من النوع البري N2 ، متحولة معيبة للتغذية DA531 Eat-1 (e2343)، وطفرات الانجذاب الكيميائي CB1033 che-2 (e1033)، FK100 الضريبة -2 (p671)، CX2065 odr-1 (n1936) و CX2205 odr-3 (n2150) تم الحصول عليها من التهاب الكينورهاب مركز علم الوراثة ، جامعة مينيسوتا.

            تم التعامل مع الديدان الخيطية بشكل أساسي كما وصفها Sulston and Hodgkin (Sulston and Hodgkin ، 1988). تم وضع ثلاثة ديدان شابة ، باستخدام منتقي سلك بلاتيني ، على صفيحة أجار وسط نمو نيماتودا (NGM) في طبق بتري بلاستيكي بطول 6 سم مزروع بـ بكتريا قولونية سلالة OP50 ، مزروعة عند 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام ، وتحافظ عليها هذه الدورة من الزراعة. تمت زراعة OP50 في وسط سائل Luria-Bertani (LB) (1٪ بولي بيبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ديفكو ، 1٪ كلوريد الصوديوم) عند 37 درجة مئوية.

            فحص لتراكم المجهرية

            ككرات مجهرية ، استخدمنا بشكل أساسي مجموعات مدى حجم فلورسبرايت بوليسترين كاربوكسيلات الأول والثاني (شركة Polysciences Inc. ذات اللون الأصفر والأخضر ، Warrington ، PA ، USA Kit I: 0.116 ± 0.005 ، 0.210 ± 0.013 ، 0.516 ± 0.011 ، 0.748 ± 0.021 و 0.968 ± 0.028 ميكرومتر بأقطار المجموعة الثانية: 1.67 ± 0.032 ، 1.83 ± 0.061 ، 2.89 ± 0.15 ، 4.87 ± 0.25 و 6.60 ± 0.60 ميكرومتر). في بعض التجارب ، تم أيضًا استخدام المجهرية Fluoresbrite® Carboxy BB (الفلورسنت الأزرق ، 0.483 ± 0.010 ميكرومتر Polysciences Inc.) في التجارب لفحص التمييز على أساس الطبيعة الكيميائية السطحية للكرات المجهرية ، الكربوكسيل ، الأمين أو اللاتكس المعدل بالكبريتات (البوليسترين). ) حبات (الفلورسنت الأصفر والأخضر ، φ1.0 ميكرومتر Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية). بصرف النظر عن المخزونات الأصلية ، تم تخزين الكرات المجهرية في الثلاجة على شكل 1/10 مخزون مخفف في 90٪ إيثانول و 1/100 مخزون مخفف في 9٪ إيثانول.

            لفحص تراكم الكرة المجهرية ، تم خلط 100 ميكرولتر من المعلق 1.0 × 10 9 مل -1 0.5 ميكرومتر أو 1.0 × 10 8 مل -1 من 1.0 ميكرومتر من الكرات المجهرية مع 100 ميكرولتر S-basal buffer (Sulston and Hodgkin ، 1988) ، ويوضع الخليط على صفيحة أجار NGM مقاس 3 سم (Sulston and Hodgkin ، 1988) وينتشر عن طريق إمالة اللوحة على مقعد نظيف. تُترك اللوحة لامتصاص السائل لمدة 30-60 دقيقة وتخزينها في حاضنة 20 درجة مئوية. لفحص الامتصاص في وجود الطعام ، بكتريا قولونية تم استرداد خلايا OP50 من لوحة استنبات NGM إلى S-basal ، وتم تعديل الكثافة وتم خلط تعليق الخلية مع تعليق microsphere. تم قياس كثافة المجهرية أو الخلايا بواسطة عداد بكتيري ومجهر.

            للمقايسة ، تم استعادة الديدان التي تم تربيتها لمدة 4 أيام من صفيحة NGM مقاس 6 سم في 1 مل من S-basal ، وبعد ترسيب الديدان ، تكرر الغسيل ثلاث مرات في المجموع عن طريق إزالة المادة الطافية ، إضافة 1 مل من S-basal الجديد والترسيب الذاتي. تم وضع خمسة عشر ميكرولترًا من المعلق الدودي المغسول على صفيحة NGM مقاس 6 سم مزروعة بـ OP50 ، وتم زراعة الديدان لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. تم بعد ذلك استعادة الديدان كما كان من قبل بغسلتين ، وتم وضع 5 ميكرولتر من المعلق الدودي على صفيحة NGM مقاس 3 سم مزروعة بكريات مجهرية محضرة كما هو مذكور أعلاه ، وتم تحضين اللوحة لامتصاص الكرات المجهرية. بعد الحضانة ، تم فصل ثلاث ديدان في وسط اللوحة عن الكرات المجهرية عن طريق الغسيل في 50 ميكرولتر من S-basal على Parafilm لمدة دقيقتين. ثم تم تخدير الديدان على وسادة أجار (Sulston and Hodgkin ، 1988) تحتوي على 200 مليمول لتر -1 Na ​​أزيد (NaN3) وتوضع على شريحة زجاجية. تم فحص الديدان الموجودة على وسادة أجار تحت مجهر نيكون ECLIPSE 80i (طوكيو ، اليابان) ، وتم التقاط الصور الدقيقة بالأبيض والأسود للكرات المجهرية باستخدام كاميرا رقمية (Digital Sight DS-2MBWc-U2، Nikon) باستخدام مرشح الكثافة المحايدة 4 (شدة ضوء الإثارة بنسبة 25٪ من الحد الأقصى) كشرط قياسي. تم تقدير مضان الكرات المجهرية المتراكمة في دودة باستخدام برنامج تحليل الصور WinROOF (Mitani Corp. Ltd ، طوكيو ، اليابان) ، وتم تصحيحه عن طريق إضافة مضان للكريات المجهرية التي تم طردها من الدودة أثناء التخدير. يعني ± sem مشتقة من مضان 10 ديدان. في بعض التجارب بدون هذا التصحيح ، تمت إضافة 50 ميكرولتر من 50 مليمول لتر -1 Na ​​أزيد إلى اللوحة لتخدير الديدان بعد امتصاصها ، ثم تم وضع 15 دودة بالغة في 200 ميكرولتر من 50 ملي مول لتر -1 Na ​​أزيد. تمت إضافة ثمانمائة ميكرولتر من S-basal ، وطرد الخليط عند 1700 ز لمدة دقيقة واحدة ، تم وضع 15 ميكرولتر من الديدان المترسبة داخل مساحة 1 سم 2 مقطوعة من قطعة من شريط لاصق مزدوج الوجه مثبت بزجاج منزلق. تم فحص الفلورة كما هو موضح أعلاه. تم تقدير عدد الكرات المجهرية المتراكمة بواسطة دودة بقسمة التألق الكلي للديدان على متوسط ​​مضان الغلاف الميكروي ، والذي تم قياسه مباشرة للكرات المجهرية وصولاً إلى 0.5 ميكرومتر وتم تقديره لـ 0.2 و 0.1 ميكرومتر من خلال العلاقة الخطية بين التألق وحجم للكرات بحجم 0.5 إلى 2 ميكرومتر.

            لمقايسة التراكم بواسطة يرقات الطور الأول (L1) ، عولجت الديدان المستزرعة لمدة 4-5 أيام بمبيض قلوي لتحضير بيض النيماتودا (Sulston and Hodgkin ، 1988). تم تحضين البيض على طبق NGM 3 سم بدون بكتيريا ، وتم استخلاص يرقات L1 الناتجة وغسلها واحتضانها لامتصاصها لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية.


            قائمة المصطلحات

            الإستقلاب

            التغيير الكيميائي بواسطة كائن حي لمركب كيميائي. يمكن أن تشمل هذه العناصر الغذائية والسموم والمواد الغريبة الحيوية.

            معايشة

            من القرون الوسطى اللاتينية كوم مينسا أو "تقاسم نفس الجدول". العلاقة بين الأفراد من نوعين ، حيث يستفيد أحد الأنواع من الآخر دون الإضرار بالآخر أو الاستفادة منه.

            حمية عذآئية

            الحد من المدخول الغذائي دون جوع مما يقلل من الخصوبة ويزيد من عمر العديد من الأنواع الحيوانية. يُعرف أيضًا باسم تقييد السعرات الحرارية.

            دسباقتريوز

            حالة اختلال التوازن الميكروبي في القناة الهضمية مما يؤدي إلى خلل في الاتزان العضلي.

            جراثيم الأمعاء

            المجتمع الجماعي للميكروبات التي تسكن الجهاز الهضمي المضيف. على عكس الديدان في البرية ، عادة ما تثار الديدان الخيطية في المختبر في وجود سلالة بكتيرية واحدة.

            هولوبيونت

            كائن حي وما يرتبط به من ميكروبات تكافلية. هذه هي وحدة الاختيار في نظرية الهولوغينوم.

            ميكروبيوم

            المحتوى الجينومي الجماعي لميكروبات الفرد.

            التبادلية

            علاقة بين أفراد من نوعين مختلفين يستفيد فيها كلا النوعين من التفاعل.

            Necromeny

            سلوك كائن حي يعلق نفسه على كائن حي مضيف ، ثم يتغذى على جثته المتحللة بعد الموت.

            باثوبيونت

            يمكن أن تسبب الأنواع الأعضاء في الكائنات الحية المجهرية التي في ظل ظروف المضيف و / أو خلل الاتزان العضلي الميكروبي علم الأمراض. متميز عن العامل الممرض.

            بروبيوتيك

            الكائنات الحية التي عند تناولها تمنح فوائد صحية للمضيف إما عن طريق التفاعل مباشرة مع المضيف أو من خلال تعديل أعضاء الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. السلالات البكتيرية من الأجناس اكتوباكيللوس و Bifidobacterium هي البروبيوتيك المرشحة.

            سيمبيونت

            كائن حي في علاقة متبادلة المنفعة مع آخر.

            تكافل

            تفاعل مفيد وثيق وطويل الأجل بين نوعين.

            داء السكري من النوع 2

            اضطراب وبائي يتميز بارتفاع نسبة الجلوكوز في الدم في سياق نقص الأنسولين النسبي ومقاومة الأنسولين. يعاني حوالي 6٪ من سكان العالم من هذا الاضطراب الأيضي.

            دودة علة

            تمت صياغة المصطلح هنا كامتداد لمفهوم الهولوبيونت. يشير إلى زوج الديدان الخيطية والميكروب ككيان غير قابل للتجزئة من حيث الجدوى والتطور.


            شاهد الفيديو: تعرف على أفضل 5 أطعمة لخفض نسبة الكوليسترول في الدم. طب الأعشاب (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Andrea

    تترك الخصائص

  2. Mel

    هذا الإصدار من العمر



اكتب رسالة