معلومة

هذه المخازن المؤقتة للربط 5X حيث تشارك التجربة؟

هذه المخازن المؤقتة للربط 5X حيث تشارك التجربة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

رأيت 5X bingind عازلة من صنع ؛

  • 100mM HEPES ، درجة الحموضة 7.6
  • 5 ملم يدتا
  • 50 ملي كبريتات الأمونيوم
  • 5 ملم DTT
  • 1٪ توين -20
  • 150 ملي كلوريد البوتاسيوم

أي رد فعل يساعد هذا المخزن المؤقت؟ أنا لا أعتبر أن هذا المخزن المؤقت يشارك في أي تجربة بالاسم. على الرغم من أن هذا المخزن المؤقت له اسم آخر ، إلا أنهم يكتبون فقط "5X عازلة للترابط" ...


الاغاروز

الاغاروز هو عديد السكاريد ، يتم استخراجه بشكل عام من بعض الأعشاب البحرية الحمراء. [1] إنه بوليمر خطي يتكون من وحدة التكرار من agarobiose ، وهو ثنائي السكاريد مكون من د-جالاكتوز و 3،6-أنهيدرو-إل-جالاكتوبيرانوز. [2] Agarose هو أحد المكونين الرئيسيين للأجار ، ويتم تنقيته من الأجار عن طريق إزالة المكون الآخر للأجار ، وهو agaropectin. [3]

كثيرا ما يستخدم Agarose في البيولوجيا الجزيئية لفصل الجزيئات الكبيرة ، وخاصة الحمض النووي ، عن طريق الرحلان الكهربائي. يتم تحضير ألواح من المواد الهلامية agarose (عادة 0.7 - 2٪) للرحلان الكهربائي بسهولة عن طريق صب المحلول السائل الدافئ في قالب. مجموعة واسعة من agaroses مختلفة من مختلف الأوزان الجزيئية والخصائص المتاحة تجاريا لهذا الغرض. يمكن أيضًا تشكيل Agarose إلى حبيبات واستخدامها في عدد من الطرق الكروماتوغرافية لتنقية البروتين.


استخدامات TBE

يعتبر المخزن المؤقت TBE مفيدًا بشكل خاص لفصل أجزاء DNA الأصغر (MW & lt 1000) ، مثل المنتجات الصغيرة من عمليات هضم إنزيم التقييد. يتمتع TBE بقدرة تخزين أكبر وسيوفر دقة أكثر وضوحًا من المخزن المؤقت TAE. TAE (Tris-acetate-EDTA) هو محلول مكون من قاعدة Tris ، وحمض الخليك ، و EDTA.

يعتبر TBE أكثر تكلفة بشكل عام من TAE ويثبط DNA ligase ، والذي قد يسبب مشاكل إذا كانت خطوات تنقية وربط الحمض النووي اللاحقة مقصودة. من خلال الخطوات الثلاث البسيطة التالية ، تعرف على كيفية عمل المخزن المؤقت TBE. من المفترض ألا يستغرق الإنشاء أكثر من 30 دقيقة.


هناك العديد من الوصفات لتحضير حل PBS. يحتوي المحلول الأساسي على الماء وفوسفات هيدروجين الصوديوم وكلوريد الصوديوم. تحتوي بعض المستحضرات على كلوريد البوتاسيوم وفوسفات هيدروجين البوتاسيوم. يمكن أيضًا إضافة EDTA في التحضير الخلوي لمنع التكتل.

لا يعتبر المحلول الملحي المخزن بالفوسفات مثاليًا للاستخدام في المحاليل التي تحتوي على كاتيونات ثنائية التكافؤ (Fe 2+ ، Zn 2+) لأن الترسيب قد يحدث. ومع ذلك ، فإن بعض حلول PBS تحتوي على الكالسيوم أو المغنيسيوم. أيضًا ، ضع في اعتبارك أن الفوسفات قد يثبط التفاعلات الأنزيمية. كن مدركًا بشكل خاص لهذا العيب المحتمل عند العمل مع الحمض النووي. في حين أن برنامج تلفزيوني ممتاز للعلوم الفسيولوجية ، كن على دراية بأن الفوسفات في عينة مخزنة في برنامج تلفزيوني قد يترسب إذا تم خلط العينة بالإيثانول.

التركيبة الكيميائية النموذجية لـ 1X PBS لها تركيز نهائي قدره 10 ملي مولار PO4 3− ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي بوكل. إليك التركيز النهائي للكواشف في المحلول:

ملح التركيز (مليمول / لتر) التركيز (جم / لتر)
كلوريد الصوديوم 137 8.0
بوكل 2.7 0.2
نا 2HPO 4 10 1.42
KH 2ص 4 1.8 0.24

شكر وتقدير

نشكر S. Berget (كلية بايلور للطب) على CD44 v4-v5 minigene ، T. Cooper (كلية بايلور للطب) للبلازميدات YB-1 ، J. Tazi (Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier) للبلازميد pET14b-hSC35 ، D. Barford (Chester Beatty Laboratories) لبروتين PP2Cα المؤتلف ، دريفوس (كلية الطب بجامعة بنسلفانيا) لجسم مضاد 4B10 خاص بـ hnRNP A1 ، S. Dokudovskaya و C. Muchardt للحصول على تعليقات مفيدة على المخطوطة ، و E. Batsché للحصول على نصائح مفيدة حول تجارب qPCR. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة بمنحة GM42699 إلى A.R.K.


4. مناقشة

في هذه الدراسة ، وجدنا أن بروتين FUBP1 يزيد من ارتباطه بـ Nrf2 mRNA وهو مطلوب من أجل من جديد ترجمة البروتين Nrf2 تحت الإجهاد التأكسدي. ميكانيكيًا ، لم يُظهر FUBP1 إزفاء السيتوبلازم ، ولكنه موجود في 40 / 43S الكسر الريبوزومي ويظهر H2ا2 زيادة تعتمد على الجرعة في الكسور الريبوسومية الكلية. ومن المثير للاهتمام أن FUBP1 يتفاعل مع eIF3 & # x003b7 على وجه التحديد ، مما يشير إلى دوره في إرفاق مجمع ما قبل البدء 43S بـ Nrf2 mRNA لبدء الترجمة. كشفت بياناتنا عن آلية جديدة للإجهاد التأكسدي الناجم من جديد ترجمة البروتين Nrf2.

تم اكتشاف بروتين FUBP1 لأول مرة كمنشط مشارك للتعظيم ج- myc النسخ بسبب ارتباطه بـ F ar U p s tream E lement (FUSE) ، في منطقة غنية بـ AT & # x022121.5 & # x000a0kb منبع ج- ميك المروج [24]. جوهر FUSE في جين c-myc هو 5 & # x02032-TATATTCCCTCGGGATTTTTTATTTTGTG-3 & # x02019 [24]. من خلال الربط بـ FUSE ، تنسق FUBP1 مع ملفات رابطة الدول المستقلة-العناصر وعوامل النسخ المقابلة لها لتعظيم معدل نسخ ملف ج- ميك الجين. ارتبط التعبير الشاذ عن FUBP1 بأنواع مختلفة من السرطانات ، وبالتالي ظهر كجينة سرطانية جديدة.

يمكن أن يرتبط FUBP1 بـ RNA في تسلسلات غنية بالبيريميدين وقد تم الإبلاغ عن ربط العديد من أنواع mRNA الخلوية وخيوط الحمض النووي الريبي الفيروسي [24]. يحتوي هذا البروتين على أربعة أشكال ترادفية K-homology (KH) ، مماثلة لتلك الموجودة في البروتين النووي غير المتجانس K (hnRNP-K) [25]. تتوسط أشكال KH ارتباط البروتين بحمض نووي منفرد أو RNA [26]. في الواقع ، KH3 أو KH4 من hnRNP كافٍ للارتباط بتسلسل TTTT أو ATTC الذي تقطعت بهم السبل ، على التوالي [27]. يحتوي Nrf2 5 & # x02032UTR على تسلسل UUUU واحد وواحد AUUAC و 7 بقع من متواليات بيريميدين الغنية ، مما يوفر مواقع الربط المحتملة لـ FUBP1. تم الإبلاغ عن أن FUBP1 يلعب دورًا في ترجمة IRES بوساطة p27 Kip mRNA [24]. تتوافق بياناتنا التي تُظهر ارتباط FUBP1 بـ Nrf2 mRNA مع دور FUBP1 في ترجمة بروتين Nrf2 بوساطة IRES تحت الإجهاد التأكسدي.

يُعرف FUBP1 أيضًا باسم عامل الربط RNA. يدعم التوطين النووي المرصود لـ FUBP1 دوره المحتمل كعامل ربط. يعزز FUBP1 أو يسهل تضفير جين Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) و MDM2 oncogene [28،29]. توجد عناصر تنظيم الربط في exons و introns إما كمعززات أو كاتمات للصوت. يمكن أن يرتبط FUBP1 بكاتم صوت التضفير الخارجي لجين ثلاثي القلب لقمع التضفير البديل [30]. مؤخرًا ، تشير قاعدتا البيانات الجينومية NCBI و Ensembl إلى أن الجين Nrf2 يشفر 8 أو 14 نسخة على التوالي ، مما يشير إلى أن جين Nrf2 يخضع لعملية تضفير بديلة. لا يزال التفاعل بين التضفير البديل وترجمة البروتين قيد الدراسة.

ينضم FUBP1 إلى La / SSB و EF1a في قائمة البروتينات التي وجد أنها تزيد الارتباط بـ Nrf2 mRNA عندما تعاني الخلايا من الإجهاد التأكسدي. لم نجد تفاعل FUBP1 مع La / SSB أو EF1a ، مما يشير إلى أن كل من هذه البروتينات ترتبط بمنطقة مميزة من Nrf2 mRNA. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن FUBP1 يستجيب للإجهاد التأكسدي بطريقة مختلفة عن La / SSB أو EF1a. بينما يرتبط EF1a بـ G-quadruplex في Nrf2 5 & # x02032UTR [13] ، ينتقل La / SSB من النوى إلى السيتوبلازم عند الإجهاد التأكسدي [12]. تم الإبلاغ عن الانتقال السيتوبلازمي لـ FUBP1 في المرحلة المبكرة من عدوى فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) أو عدوى الفيروس المعوي 71 (EV71) [31،32]. على عكس هذه البروتينات الفيروسية ، لا يبدو أن ترجمة البروتين Nrf2 عبر مشاركة FUBP1 تنطوي على الانتقال النووي إلى السيتوبلازم. تشير حقيقة أن FUBP1 تم اكتشافه في العصارة الخلوية وزيادة وجوده في الكسور الريبوزومية إلى أن إعادة توزيع FUBP1 العصاري الخلوي ليكون مرتبطًا بالريبوسومات أمر مهم من أجل من جديد ترجمة البروتين Nrf2.

تم تحسين التفاعل بين FUBP1 و eIF3 & # x003b7 على H.2ا2 العلاج (الشكل 13). يعد عامل البدء eIF3 & # x003b7 واحدًا من 13 وحدة فرعية لمجمع 800 kD eIF3 الذي يعزز تجميع مجمع ما قبل البدء 43S وارتباطه بـ mRNA المشغول مسبقًا بمجمع eIF4F (eIF4E و eIF4G و eIF4A). مع ترجمة البروتين الفيروسي بوساطة IRES ، تم إثبات مشاركة eIF3 منذ فترة طويلة [33،34]. بالنسبة لـ IRES الخلوية ، فقد ثبت أن eIF3 يتوسط 5 & # x02032UTR في بدء الترجمة المعتمدة على XIAP و c-Jun [[35] ، [36] ، [37]]. التفاعل المادي لـ FUBP1 مع eIF3 & # x003b7 المكتشف هنا يدعم دور FUBP1 في تعزيز ربط مركب ريبوسوم 43S قبل البدء بـ Nrf2 mRNA لبدء الترجمة.

التفسير المعقول للزيادة الملحوظة في ارتباط FUBP1 بـ Nrf2 mRNA هو أن FUBP1 يخضع لتعديلات ما بعد الترجمة عند الإجهاد التأكسدي. تم الإبلاغ عن FUBP1 في كل مكان بواسطة p38 / JTV-1 عند الطرف C ، مما يؤدي إلى تحللها البروتيني [38]. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن أيضًا إزالة انتشار FUBP1 عن طريق البروتياز 22 الخاص بـ Ubiquitin (USP22) ، مما يؤدي إلى تقليل ارتباط FUBP1 بـ FUSE [39]. تتسبب التعديلات اللاحقة للترجمة ، مثل التواجد في كل مكان أو السومويليشن ، في حدوث تغييرات في الأوزان الجزيئية و / أو شحنات البروتينات ، والتي يمكن اكتشافها بواسطة الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد. يجادل نقص تغيير الوزن الجزيئي في لطخة غربية ثنائية الأبعاد ضد التواجد في كل مكان أو السومويليشن في FUBP1 بسبب H2ا2 علاج او معاملة. بينما أظهر الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد انخفاض PI لـ FUBP1 في الخلايا المعالجة بـ H.2ا2 العلاج ، فشلت الأجسام المضادة التي تكشف عن الفسفرة في الإشارة إلى مثل هذا التعديل اللاحق للترجمة. لم يكشف الاكتشاف الأولي لـ FUBP1 باستخدام LC-MS / MS عن الفسفرة أو التواجد في كل مكان. لذلك ، لا يزال يتعين تحديد مسار الإشارات المؤدي إلى زيادة ارتباط FUBP1 بـ Nrf2 mRNA.


المقدمة

في مختلف الأحداث الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني ، والاستجابات الالتهابية والمناعة ، والورم الخبيث السرطاني ، فإن هجرة الخلايا التي تستجيب للإشارات البيئية هي آلية محورية (Bravo-Cordero وآخرون.، 2012 Solnica-Krezel and Sepich، 2012 Kolaczkowska and Kubes، 2013). تتطلب عملية الترحيل تنسيق مسارات الإشارات وآلية الحركة (Insall ، 2013) ، ولا يزال يتعين توضيح الشبكة الجزيئية الأساسية المعقدة بشكل كامل.

تتضمن هجرة الخلايا حقيقية النواة عمومًا تغييرات جذرية في شكل الخلية مدفوعة بإعادة ترتيب الهيكل الخلوي. في حركة الزحف للخلايا ، تحدث إعادة التنظيم المستمرة ودوران الهيكل الخلوي للأكتين (بولارد وبوريسي ، 2003). في مقدمة الخلية ، تؤدي بلمرة الأكتين السريعة إلى تمديد نتوءات الغشاء مثل lamellipodia و filopodia (Bisi وآخرون.، 2013). تلتصق النتوءات الخلوية الجديدة بالطبقة التحتية من خلال البروتينات التي يمكنها إشراك المصفوفة خارج الخلية لتوفير نقاط الربط. من أجل حركة الهجرة المثلى ، تحتاج الخلية إلى القدرة على الانكماش لدفع انتقال جسم الخلية الزائدة ، وتعتمد هذه القدرة على التفاعل بين خيوط الأكتين والميوسين (كرامر ، 2013). يتم فصل الجزء الخلفي من الخلية عن الالتصاق الأصلي للسماح للخلية بتقدم خطوة. تسير هذه الأحداث بطريقة دورية ويتم تنسيقها مكانيًا وزمنيًا (Lauffenburger and Horwitz، 1996 Maruthamuthu وآخرون., 2010).

يتم التحكم في إعادة التنظيم الديناميكي للهيكل الخلوي للأكتين بشكل معقد من خلال عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs Winder and Ayscough ، 2005). يتعايش شكلان من الأكتين - الأكتين الكروي الأحادي والأكتين البوليمر الخيطي - في الخلايا في توازن ديناميكي تضيف مونومرات ATP-G-actin إلى النهاية الشائكة ، وتنفصل الوحدات الفرعية ADP-G-actin عن الطرف المدبب لـ F اكتين. تخضع مونومرات ADP-G-actin التي تم إصدارها لتبادل النوكليوتيدات لتجديد تجمع ATP-G-actin الخلوي لجولات جديدة من تجميع خيوط الأكتين. تم تحديد العديد من ABPs وتصنيفها إلى عدد قليل من العائلات الرئيسية استنادًا إلى مجالات ربط الأكتين ، بما في ذلك مجال تماثل عامل إزالة بلمرة الأكتين (ADF-H) ، ومجال تماثل الجلسولين ، وتماثل بروتين متلازمة Wiskott – Aldrich (WASP )- 2 (WH2) ومجال تماثل الكالبونين (CH) والمجال الحركي للميوسين (Paunola) وآخرون.، 2002 ماكجو وآخرون.، 2003 ديسانزا وآخرون.، 2005 فريدبرغ وريفيرو ، 2010 بوكولا وآخرون.، 2011 هارتمان وسبوديتش ، 2012). يمكن أن ترتبط ABPs بـ G-actin و / أو F-actin وتنظم الهيكل الخلوي للأكتين بطرق مختلفة (Winder and Ayscough ، 2005). على سبيل المثال ، يرتبط مركب Arp2 / 3 بالأكتين ويعمل كعامل تنوي لتعزيز تفرع الخيوط (Machesky وآخرون.، 1997 Machesky and Insall ، 1998). يعتبر أفراد عائلة ADF / cofilin عوامل التفكيك مع أنشطة قطع الشعيرات (Prochniewicz وآخرون.، 2005). تشمل الأنشطة الأخرى لـ ABPs تغطية الفتيل ، وإزالة التفرعات ، وربط المونومر ، والتجميع ، والربط المتبادل (Winder and Ayscough ، 2005). لا تزال مجموعة منظمات الأكتين تتوسع ، ولا تزال الأدوار الخلوية للعديد من ABPs بعيدة المنال.

ديسكويستيليوم ديسكويديوم هي حقيقيات النوى البسيطة التي تعرض الهجرة الكيميائية في مراحل متعددة من دورة حياتها. أثناء النمو ، ديكتيوستيليوم تهاجر الأميبات نحو البكتيريا وتستهلكها بالبلعمة كغذاء لها. تحت استنفاد المغذيات ، ديكتيوستيليوم تدخل الخلايا في برنامج تنموي تتحرك فيه الخلايا المفردة بشكل جماعي نحو إشارات cAMP المنبعثة من الخلايا المركزية المعينة ، وتشكل مجاميع تخضع لاحقًا للتمايز والتشكل لتتحول إلى هياكل متعددة الخلايا (Kay ، 2002 Weijer ، 2009). مع العديد من أدوات الوراثة الجزيئية المتاحة والحالة الفردية المثالية للفحص الجيني ، ديكتيوستيليوم تم استغلاله على نطاق واسع في دراسة هجرة الخلايا وتنظيم الأكتين (Egelhoff and Spudich ، 1991 Noegel and Schleicher ، 2000).

للكشف عن لاعبين جزيئيين جدد في المسارات الكامنة وراء هجرة الخلايا الكيميائية ، أجرينا سابقًا شاشة ديكتيوستيليوم المسوخات معيبة في الاستجابات الكيماوية لـ cAMP (Pang وآخرون.، 2010). في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل متحولة تم جمعها في الشاشة وحددنا بروتينًا جديدًا مرتبطًا بالأكتين يشارك في تعديل هجرة الخلايا.


الوصفة النموذجية لصنع محلول 1X TE هي:

يسمى عازلة TE أيضًا باسم T10ه1 المخزن المؤقت ، ويقرأ على أنه "T ten E one buffer". لعمل 100 مل من محلول T.10ه1 يتم خلط المخزن المؤقت ، 1 مل من 1 M Tris base (pH 10-11) و 0.2 ml EDTA (0.5 M) مع ماء مقطر مزدوج حتى 100 مل. أضف كميات ميكروليتر من مولارية عالية حمض الهيدروكلوريك لخفض الرقم الهيدروجيني إلى 8.

استنادًا إلى دراسات نوكلياز من الثمانينيات ، يتم تعديل الأس الهيدروجيني عادةً إلى 7.5 للحمض النووي الريبي و 8.0 للحمض النووي. [ بحاجة لمصدر ] من المفترض أن تكون نوكليازات الحمض النووي والحمض النووي الريبي ذات الصلة أقل نشاطًا عند قيم الأس الهيدروجيني هذه ، ولكن يمكن استخدام الأس الهيدروجيني 8.0 بأمان لتخزين كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي [ بحاجة لمصدر ] .

يعمل EDTA على إبطال نشاط DNase أيضًا ، عن طريق الارتباط بالكاتيونات المعدنية التي يتطلبها هذا الإنزيم. [1]

يمكن تخزين الحمض النووي الجينومي والبلازميد في TE Buffer عند 4 درجات مئوية (39.2 درجة فهرنهايت) للاستخدام على المدى القصير ، أو -20 درجة مئوية (-4 درجة فهرنهايت) إلى -80 درجة مئوية (-112 درجة فهرنهايت) لفترة طويلة تخزين المدى. يجب تجنب دورات التجميد-الذوبان المتكررة. [2]

يعتمد تشغيل المخزن المؤقت TE على الكاتيونات المعدنية المخلبية مثل Mg 2+. تكمن المشكلة في أن بوليميراز PCR يتطلب أيضًا Mg 2+ للعمل ، لذلك إذا كانت كمية EDTA عالية جدًا فقد تؤثر على PCR. هناك نسخة من المخزن المؤقت TE مع كمية أقل بعشر مرات من EDTA والتي تستخدم بشكل متكرر لمجموعات STR الخاصة بالطب الشرعي. نظرًا لاستخدام مجموعات مع تضخيم تعدد الإرسال ، من الضروري الحصول على كمية أقل من EDTA في العينة حتى لا تتداخل مع Mg 2+ الموجود في التفاعل. إذا تم استخدام عازلة TE العادية لتخفيف العينة ، فسيتم ملاحظة عدم توازن في ملف تعريف الحمض النووي ، أثناء انخفاض TE سيكون له توازن أفضل. ال عازلة TE منخفضة أو عازلة منخفضة EDTA يتكون من 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) + 0.1 ملي مول EDTA.

    ، عازلة بورات الليثيوم ، وهي عبارة عن عازلة مماثلة تحتوي على أيونات الليثيوم بدلاً من Tris و TBE العازلة غالبًا ما تستخدم في الإجراءات التي تشمل الأحماض النووية ، وأكثرها شيوعًا هي الرحلان الكهربائي.

عازلة ph7.4 TE = 100mM / L Tris (pH7.4) + 10mM / L EDTA (pH8.0) من الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر


المقدمة

تشمل الاستجابات الخلوية للإجهاد السام للجينات توقف دورة الخلية ، وإصلاح الحمض النووي ، والتغيرات في النسخ ، والاستماتة. مسارات نقل الإشارة التي تبدأ بتنشيط كينازات البروتين الشبيهة بالفوسفوينوزيتيد -3 كيناز ، بما في ذلك ترنح توسع الشعيرات المتحور (ATM) و ATM- و Rad3 (ATR) ، تنسق استجابات تلف الحمض النووي هذه.

تشترك أجهزة الصراف الآلي و ATR في تجانس التسلسل والركائز والوظائف. يتسبب فقدان نشاط ATM أو ATR في ظهور أنماط ظاهرية خلوية مماثلة ، بما في ذلك فقدان نقاط تفتيش دورة الخلية وزيادة الحساسية لتلف الحمض النووي (Abraham ، 2001 Shiloh ، 2001). يتمثل أحد الاختلافات بين مسارات الإشارات هذه في أن أجهزة الصراف الآلي تستجيب بشكل أساسي لفواصل شرائط الحمض النووي المزدوجة ، بينما تستجيب ATR للعديد من أشكال الإجهاد السام الجيني ، بما في ذلك الروابط المتقاطعة للحمض النووي ، وتعديلات القاعدة ، وتوقف شوكات النسخ المتماثل. السؤال الرئيسي هو ما الذي يسمح لـ ATR بالاستجابة لمجموعة متنوعة من الإهانات الجينية ، في حين أن أجهزة الصراف الآلي تقتصر في المقام الأول على فواصل الخيوط المزدوجة.

جاء دليل مهم للاختلافات البيوكيميائية بين ATM و ATR مع تحديد البروتين الإضافي الذي يعمل حصريًا مع ATR (Edwards وآخرون. ، 1999 باشيوتي وآخرون. ، 2000 روس وجاكسون ، 2000 كورتيز وآخرون. ، 2001 واكاياما وآخرون، 2001). هذا البروتين ، Rad26 in شيزوساكارومايس بومب، DDC2 / LCD1 / PIE1 بوصة خميرة الخميرة، أو ATRIP في البشر ، يرتبط بـ ATR وهو مطلوب لإشارة ATR. يؤدي حذف جينات الخميرة ATRIP أو تثبيط RNA لتعبير ATRIP في الخلايا البشرية إلى أنماط ظاهرية متطابقة تقريبًا كما لوحظ عند حذف ATR (Uchiyama وآخرون. ، 1997 إدواردز وآخرون. ، 1999 باشيوتي وآخرون. ، 2000 روس وجاكسون ، 2000 كورتيز وآخرون. ، 2001 واكاياما وآخرون، 2001). الأهم من ذلك ، لا يرتبط ATRIP بـ ATM (Cortez وآخرون، 2001). وبالتالي ، فإن إحدى الفرضيات لشرح كيف يمكن تنشيط ATR بواسطة ضغوط سامة جينية مختلفة عن ATM هي أن ATRIP يوفر خصوصية موسعة. جاء الدليل الثاني لكيفية تنشيط ATR بشكل مختلف عن أجهزة الصراف الآلي مع ملاحظة أن تنشيط ATR غالبًا ما يتطلب تكرار الحمض النووي (مايكل وآخرون. ، 2000 الذئبة وآخرون. ، 2002 Tercero وآخرون. ، 2003). قد يكون تفاعل شوكة النسخ المتماثل مع آفة الحمض النووي ضروريًا لتنشيط ATR في العديد من الظروف. في الواقع ، زاد ATR من نشاطه أثناء تكرار الحمض النووي الطبيعي في خلايا الخميرة و Xenopus مستخلصات البيض (إدواردز وآخرون. ، 1999 باشيوتي وآخرون. ، 2000 شيشتر وآخرون. ، 2004) ، و ATR هو جين أساسي في دوران خلايا الإنسان والفأر (Brown and Baltimore، 2000 Cortez وآخرون، 2001). علاوة على ذلك ، فسفرة ATR بعض مكونات شوكة النسخ المتماثل ، بما في ذلك مجمع هليكاز MCM (كورتيز وآخرون., 2004).

يبقى السؤال كيف يمكن لمركب بروتين كينيز أن يستجيب لمثل هذه الإهانات الجينية المتنوعة مثل الوصلة المتقاطعة أو شوكة النسخ المتوقفة أو كسر الشريط المزدوج؟ يقترح أحد النماذج أن ATR يتم تنشيطه عن طريق الارتباط المادي بمواقع تلف الحمض النووي أو شوكات النسخ المتماثل المتوقفة. في الواقع ، يتم نقل كل من ATR و ATRIP إلى بؤر داخل النواة استجابة لتلف الحمض النووي وجزء من هذه البروتينات مرتبط بالكروماتين (حكمت نجاد وآخرون. ، 2000 كورتيز وآخرون. ، 2001 Lupardus وآخرون. ، 2002 دارت وآخرون، 2004). الملاحظات التي تم إعاقة تنشيط ATR فيها Xenopus مقتطفات عن طريق استنفاد الحمض النووي الريبي (ssDNA) المرتبط بالبروتين المفرد الذي تقطعت به السبل ، ويضعف توطين ATR للبؤر في الخلايا البشرية عندما يتم تثبيط تعبير RPA عن طريق تثبيط RNA يدعم هذا النموذج (Costanzo وآخرون. ، 2003 Zou and Elledge ، 2003 Dart وآخرون، 2004). علاوة على ذلك ، ثبت مؤخرًا أن ATRIP يرتبط بـ ssDNA المغلف بـ RPA مباشرة (Zou and Elledge ، 2003) ، ولا يتم توطين DDC2 في مواقع تلف الحمض النووي في طفرات الخميرة المعيبة في بروتين الربط المفرد RFA1 (Lisby) وآخرون، 2004). وبالتالي ، قد تعزز ATRIP إعادة تحديد موقع معين وتنشيط ATR استجابة لمجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي التي تتم معالجتها لفضح ssDNA المرتبط بـ RPA.

في هذه الدراسة ، اختبرنا نموذج التوظيف ssDNA-RPA مباشرة لتفعيل ATRIP-ATR. بشكل مثير للدهشة ، تشير بياناتنا إلى أن التفاعل بين ssDNA-RPA و ATRIP ليس كافيًا لتراكم ATRIP في آفات الحمض النووي ولا ضروريًا تمامًا لإشارات نقطة التفتيش المعتمدة على ATR.


المواد والأساليب

خطوط الخلايا وزراعة الخلايا وخلايا CIRP KO

تمت زراعة خلايا HTC75 و HeLa و U2OS و 293T باستخدام وسط Dulbecco's Eagle المعدل (DMEM ، Gibco) الذي يحتوي على 10 ٪ FBS و 1 ٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 32 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون.2. خلايا HEK293T المستخدمة لإنتاج الفيروسات القهقرية وتجارب تعداء عابرة. تم استنساخ (كدنا) CIRP كامل الطول أو متحولة في ناقلات الفيروسات القهقرية القائمة على pBabe للتعبير عن الثدييات (50). تم تمييز CIRP بـ S ، FLAG ، SBP عند المحطة C. أصيبت خلايا HTC75 المستقرة بالفيروسات القهقرية المناسبة قبل اختيار البوروميسين (1 مجم / مل لمدة 7 أيام). من أجل التزامن ، تمت زراعة الخلايا في وسط DMEM خالي من FBS لمدة 24 ساعة ثم نمت في وسط جديد يحتوي على 10٪ FBS لمدة 24 ساعة وحصادها في النقاط الزمنية المحددة.

لتوليد خلايا CIRP KO HTC75 ، استهدفنا exon 4. تم استنساخ sgRNA (5′-AACCGATCCCGTGGGTACCG) في المتجه الموصوف بواسطة مختبر الكنيسة (Addgene) (51). يرجى الاطلاع على الشكل التكميلي S1 للحصول على تفاصيل حول الاستنساخ. لإنشاء خلايا CIRP KO HeLa ، استهدفنا exon 2 (sgRNA ، 5′-GCCATGGCATCAGATGA) و exon 7 (sgRNA ، 5′-CATCGATGTTGTATTTGCAG) ، بهدف حذف المنطقة بأكملها بين تسلسل الهدف sgRNA. تم استنساخ sgRNAs في ناقل Lenti gRNA Blasticidin / Puromycin / Phage-Lenti-Inducible-Cas9-neo الموصوف بواسطة مختبر تشانغ (Addgene) (52). تم عزل استنساخ KO كما هو موصوف (51 ، 52) واستخراج الحمض النووي الجيني الخاص بهم للتسلسل. تم تأكيد KO الناجح أيضًا عن طريق التخمير المناعي.

تم استنساخ متواليات shRNA في ناقلات الفيروسات القهقرية pcl-mU6. تسلسل الاستهداف لمختلف shRNAs و siRNAs هي:

SiCIRP-1 (CIRBP / HSS101939) سيرنا

SiCIRP-2 (CIRBP / HSS174416) سيرنا

SiCIRP-3 (CIRBP / HSS174417) سيرنا

طيف كتلة الترسيب المناعي (IP-MS)

تم إنشاء خلايا 293T تعبر بشكل ثابت عن TERT كامل الطول بعلامات SFB من أجل IP الترادفي متبوعًا بقياس الطيف الكتلي (IP-MS) كما ورد سابقًا (53). تم تأكيد التعبير عن TERT-SFB عن طريق التخمير المناعي المضاد للعلم. لتنقية التقارب ، تم جمع و gt2 × 10 8 خلايا مع محلول NETN (20 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 1 مم EDTA ، و 0.5٪ Nonidet P-40) تحتوي على 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين A وأبروتينين ، 1 ملي MgCl2 و 250 U / Ml Benzonase Nuclease (EMD Chemicals) لمدة 25 دقيقة. تم تحضين المستحلبات التي تم تطهيرها باستخدام 200 ميكرولتر من حبات تقارب M2 المضادة للعلم (A2220 ، Sigma) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية وتم التصفية باستخدام 3 مجم / مل من البيوتين (Sigma) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. تم تحضين الواتس مع 100 ميكرولتر من حبات agarose بروتين S (Novagen) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية قبل SDS / PAGE و MS (مرفق Taplin Biological MS ، جامعة هارفارد). تم استبعاد البروتينات التي تحتوي على الببتيدات & lt3 أو الموجودة في عينات IP للتحكم (الجدول التكميلي S1).

مقايسة تكملة التألق ثنائي الجزيء (BiFC) ، مقايسة الترسيب المناعي المشترك (Co-IP) والنشاف الغربي

بالنسبة لـ BiFC ، تم التعبير عن البروتينات التي تم تمييزها على التوالي بواسطة YFPn (بقايا 1-155 من Venus YFP) و YFPc (بقايا 156-239 من YFP) بشكل مشترك في خلايا HTC75 للفحص المجهري وتحليل التدفق الخلوي كما هو موضح سابقًا (54). بالنسبة إلى النشاف الغربي ، تم فصل الخلايا في محلول NETN 1x (1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، و 1 مم EDTA ، و 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 0.5٪ NP-40 ، و 1 ملي مولار DTT وكوكتيل مثبط البروتين قبل SDS-PAGE وسبر الأجسام المضادة.

الأجسام المضادة المستخدمة هي: أرنب متعدد النسيلة مضاد لـ CIRP (ab94999 ، Abcam) ، جل تقارب مضاد لـ FLAG M2 (Sigma ، A2220) ، مضاد علم متعدد الأضلاع (Sigma ، F7425) ، فأر وحيد النسيلة مضاد لـ GST (Abmart ، M20007M) ، مضاد للأكتين متعدد الأضلاع للأرنب (GeneTex ، GTX109639) وفأر وحيد النسيلة مضاد لـ GAPDH (Abmart ، M20006). تم سحب البروتينات الموسومة بعلامة GST بواسطة حبات الجلوتاثيون agarose (GE).

التألق المناعي (IF) وفلوريسنت IF فى الموقع تهجين (IF-FISH)

تم إصلاح الخلايا المزروعة على أغطية زجاجية لمدة 15 دقيقة على الجليد في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 4 ٪ بارافورمالدهيد ، المحتضنة في محلول نفاذية (0.5 ٪ Trition-X 100 ، 20 مم HEPES ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي MgCl2 و 300 ملي سكروز) لمدة 10 دقائق ، يليها نفاذية ثانية لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة بعد الغسل في 1x PBS. ثم تم حظر الأغطية في مصل الماعز بنسبة 3 ٪ بالإضافة إلى 0.1 ٪ من مساحة سطح الجسم في 1x PBS متبوعًا بالحضانة بالأجسام المضادة الأولية (طوال الليل عند 4 درجات مئوية) والأجسام المضادة الثانوية (ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة). تشمل الأجسام المضادة الأولية مضاد CIRP للأرنب متعدد النسيلة (ab94999 ، Abcam) ، مضاد لفائف الفئران وحيدة النسيلة [IH10] (ab87913 ، Abcam) ، مضاد لـ HA أحادي النسيلة (H9658 ، Sigma) ، مضاد لـ TRF2 (OP129 ، Calbiochem). تشمل الأجسام المضادة الثانوية IgG المترافق مع الماعز والأرنب / الفأر (DyLight549 ، LK-GAR5492 ، Liankebio) والماعز المضاد للأرانب / الفأر IgG (DyLight488 ، LK-GAM4881 ، Liankebio). بالنسبة لـ IF-FISH ، تم إجراء حضانة إضافية باستخدام مسبار PNA-TelC-FITC (Panagene) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم تركيب Coverslips باستخدام Vectashield Mounting Medium الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل DAPI وفحصها على مجهر نيكون Ti مضان.

بروتوكول تضخيم التيلومير المتكرر (TRAP) و IP-TRAP

تم استنبات الخلايا عند درجة الحرارة المحددة (32 درجة مئوية / 37 درجة مئوية ، على التوالي) وتم حصادها في نقاط زمنية مختلفة لمقايسة TRAP المستقيمة أو الترسيب المناعي متبوعًا بـ TRAP (IP-TRAP) كما هو موضح سابقًا (17). تم حل المنتجات على مواد هلامية بولي أكريلاميد (8٪) وتم تصورها باستخدام هلام أحمر (Biotium). تم حساب نشاط التيلوميراز النسبي باستخدام برنامج ImageQuant (GE Healthcare).

تنقية البروتين ومقايسة تحول الحركة الكهربي (EMSA)

تمت تنقية CIRP و DKC1 المعبر عنها بجراثيم GST باستخدام حبات agarose المقترنة بالجلوتاثيون ، وتمت التصفية التتابعية في 50 ملي مولار من Tris (درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 50 ملي مولار من الجلوتاثيون المختزل (GE). بالنسبة لـ EMSA ، تم تحضين بروتينات CIRP-GST المنقى باستخدام مسبار TERC المسمى T7 المسمى T7 (Ambion) (يرجى الاطلاع على المواد التكميلية للحصول على التفاصيل المتعلقة بإعداد المسبار). تم إجراء تفاعلات الربط عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت للربط (100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولاريتر (درجة الحموضة 7.5) ، 5 ٪ (وزن / حجم) جلسرين ، 1 ملي مولار كلوريد الصوديوم2، 1 يو من RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega) و 0.3 pmol من 32 مسبار TERC المسمى P). تم حل المنتجات على 5 ٪ (وزن / حجم) هلام PAGE الأصلي (100 V ، 0.5x TBE ، 180 دقيقة) ، وتم تصورها على Typhoon PhosphorImager (شركة جنرال إلكتريك) وقياسها باستخدام ImageQuant (Amersham Biosciences).

تحليل شظية تقييد التيلومير (TRF)

تم تحديد متوسط ​​طول التيلوميرات باستخدام تحليل مقايسة TRF كما هو موضح سابقًا (12). تم هضم الحمض النووي الجيني المعزول باستخدام Hinf I و Rsa I وتم حله على 7 ٪ من المواد الهلامية agarose (2 V / cm ، 27 h). تم تهجين الهلام المجفف مع 32 قليل النوكليوتيدات المسمى P [(TTAGGG)4] ، تعرض لشاشة PhosphorImager (55) وكميات على Typhoon PhosphorImager (شركة جنرال إلكتريك).


إن قضاء الوقت والمال فقط في تحسين الاختبارات وعدم توليد بيانات قابلة للاستخدام أمر محبط للغاية ، خاصة عندما يكون لديك موارد محدودة. لدى Monolith طرق لمساعدتك على البدء بخطوة وضع العلامات المستهدفة ، ومع تحسين ظروف الاختبارات الخاصة بك حتى تتمكن من الوصول إلى نتائج قابلة للتنفيذ في وقت أقرب.

يبدأ نجاحك باختيار استراتيجية التصنيف الصحيحة
يمنحك مساعد تسمية البروتين التفاعلي عبر الإنترنت أفضل توصيات وضع العلامات للبروتين المستهدف وبصريات جهازك.

كن واثقًا من أن لديك الظروف العازلة المناسبة
يجعل برنامج MO.Control 2 من السهل للغاية التحقق من تأثيرات المخازن المؤقتة على تفاعلاتك. استفد من القدرة على تشغيل 24 من الشعيرات الدموية لفحص ما يصل إلى 6 حالات مختلفة للمخزن المؤقت في التكرارات مع وجود عناصر تحكم بدون ترابط في نفس التشغيل. اقرأ الملاحظة الفنية للحصول على مثال لمدى سهولة العثور على ظروف المخزن المؤقت الصحيحة.

ابحث عن أفضل ظروف المخزن المؤقت في وقت أقل
استخدم أداة Buffer Exploration Kit ، وهي عبارة عن لوحة مكونة من 96 بئرًا ومحملة بمخازن مؤقتة جاهزة للاستخدام شائعة الاستخدام في فحوصات MST حتى لا تضطر إلى مزجها مسبقًا بنفسك. يجعل الفحص المؤقت أقل استهلاكا للوقت.

احصل على فحوصات جودة فورية
تتم باستمرار مراقبة معلمات الجودة الرئيسية مثل التجميع ، وتبييض الصور ، وانخفاض الإشارة إلى الضوضاء. إذا كان التحسين الإضافي ضروريًا ، فستحصل على توصيات حول كيفية تصحيح هذه المشكلات.


شاهد الفيديو: КОСЯКИ iPhone 11 и не только (قد 2022).