معلومة

4.8: معلمات الإنزيم - علم الأحياء

4.8: معلمات الإنزيم - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

(V_ {max} ) & (K_ {cat} )

في مخطط السرعة مقابل تركيز الركيزة (V مقابل [S]) ، فإن السرعة القصوى (المعروفة باسم Vmax) هي القيمة على المحور Y التي يقتربها المنحنى بشكل مقارب. تجدر الإشارة إلى أن قيمة V max تعتمد على كمية الإنزيم المستخدم في التفاعل. ضاعف كمية الإنزيم ، ضاعف الـ Vmax. إذا أراد المرء مقارنة سرعات إنزيمين مختلفين ، فسيكون من الضروري استخدام نفس كميات الإنزيم في التفاعلات المختلفة التي يحفزها. من المستحسن أن يكون لديك مقياس للسرعة مستقل عن تركيز الإنزيم. لهذا ، نحدد قيمة Kcat ، والمعروفة أيضًا باسم رقم الدوران. رياضيا ،

[ text {Kcat} = frac {V_ {max}} {[Enzyme]} tag {4.7.1} ]

لتحديد Kcat ، يجب على المرء أن يعرف بوضوح Vmax عند تركيز معين من الإنزيم ، لكن جمال المصطلح هو أنه مقياس للسرعة مستقل عن تركيز الإنزيم ، وذلك بفضل المصطلح الموجود في المقام. وبالتالي فإن Kcat هو ثابت لإنزيم في ظل ظروف معينة. وحدات K cat هي ( text {time} ^ {- 1} ). سيكون المثال 35 / ثانية. هذا يعني أن كل جزيء من الإنزيم يحفز تكوين 35 جزيءًا من المنتج كل ثانية. في حين أن ذلك قد يبدو ذا قيمة عالية ، إلا أن هناك إنزيمات معروفة (كربونيك أنهيدريز ، على سبيل المثال) التي لها قيم Kcat تبلغ (10 ​​^ 6 ) / ثانية. يوضح هذا الرقم المذهل بوضوح لماذا تبدو الإنزيمات سحرية في عملها.

(كم)

معلمة أخرى من الإنزيم المفيد تُعرف باسم KM ، ثابت ميكايليس. ما يقيسه ، بعبارات بسيطة ، هو تقارب الإنزيم مع ركائزه. تختلف تقاربات الإنزيمات للركائز بشكل كبير ، لذا فإن معرفة KM يساعدنا على فهم مدى ملاءمة الإنزيم للركيزة المستخدمة. يعتمد قياس KM على قياس Vmax. على مؤامرة V مقابل [S] ، يتم تحديد KM كقيمة x التي تعطي Vmax / 2. هناك خطأ شائع يرتكبه الطلاب في وصف V max وهو قولهم إن KM = Vmax / 2. وهذا بالطبع ليس صحيحا. KM هو تركيز الركيزة وهو مقدار الركيزة التي يحتاجها الإنزيم للوصول إلى Vmax / 2. من ناحية أخرى ، فإن Vmax / 2 هي سرعة وليست أكثر من ذلك. ترتبط قيمة KM عكسيًا بتقارب الإنزيم في ركائزه. تتوافق القيم العالية لـ KM مع تقارب إنزيم منخفض للركيزة (يتطلب الأمر مزيدًا من الركيزة للوصول إلى Vmax). تتوافق قيم KM المنخفضة للإنزيم مع التقارب العالي للركيزة.


معلمات ركوب PCR & ndashSix اعتبارات رئيسية للنجاح

يجب إعداد معلمات تدوير وتشغيل PCR للتضخيم الفعال ، بمجرد تحديد الكميات المناسبة من مدخلات الحمض النووي ومكونات PCR. ستؤثر خصائص بوليميرات الحمض النووي وأنواع مخازن تفاعل البوليميراز المتسلسل وتعقيد قالب الحمض النووي على إعداد ظروف التفاعل هذه. تناقش الأقسام الموجودة في هذه الصفحة الاعتبارات العامة لمعلمات تدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بدءًا من توضيح الخطوات الرئيسية لعملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (شكل 1).

على هذه الصفحة:

الشكل 1. رسم توضيحي للخطوات الرئيسية في PCR - التقليل ، التلدين ، التمديد - لتضخيم تسلسل الهدف من قالب DNA.

فيديو: مبادئ PCR

يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على ثلاث خطوات دورة حرارية لتضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف. يشرح هذا الفيديو كيفية عمل هذه الخطوات الثلاث في تفاعل البوليميراز المتسلسل.


النطاقات الطبيعية لبعض معايير كيمياء الدم في أسماك السلمون الأطلسي المستزرعة البالغة ، Salmo salar

تم جمع عينات الدم من سمك السلمون الأطلسي البالغ الذي تم تغذيته على نظام غذائي مثالي في حظائر البحر الشبكي على فترات من أكتوبر إلى مايو. تم إجراء تحاليل الدم وتحليل المصل الكيميائي الحيوي على 20 سمكة في كل عينة من العينات السبعة. كانت نطاقات القيم المنطقية للدم لعينة العينة هي: الهيماتوكريت 44-49٪ ، الهيموغلوبين 8.9-10.4 جم 100 مل -1 ، عدد خلايا الدم الحمراء 0.85-1.10 × 10 12 لتر -1 ، MCV 441-553 × 10 15 1 ، MCH 94-106 × 10 6 جم ، MCHC19.4-21.7 جم 100 مل -1 ولوكريت 0.43-0.96٪. نطاقات أنشطة الإنزيم في مصل الدم ، بالنسبة لعينة العينة ، كانت: الفوسفاتيز القلوي 647-988Ul −1 ، الأسبارتات أمينوترانس-فيراز 202-351 Ul 1 والألانين أمينوترانسفيراز 4-8 Ul 1. كانت نطاقات المعلمات الأخرى التي تم تحليلها في مصل الدم هي: البروتين الكلي 41.6-56.6 جالون -1 ، الألبومين 18.3-24.3 جالون -1 ، نسبة الألبومين / البروتين الكلي 39.3-44.0٪ ، الكرياتينين 26-46 ميكرولتر ، الدهون الثلاثية 2.53-4.98 ميكرولتر و الكوليسترول 9.3-12.8 ميكرولتر. تعتبر هذه القيم هي النطاقات الطبيعية في الأسماك الصحية. تمت مناقشة الاختلافات بسبب التغيرات الموسمية ، والأهمية السريرية للمعلمات المختارة. يتم عرض البيانات التي تبين استنساخ التحليلات البيوكيميائية في مصل الدم.


وصف النموذج وتطويره

أبسط نموذج لآلية التفاعل المحفز بالإنزيم معطى في الشكل 1. تتكون الآلية من خطوتين الأولى هي ربط الإنزيم بالركيزة ، والثانية تتضمن كلاً من تحفيز التفاعل وإطلاق المنتج. يتم تحديد ارتباط الركيزة بالإنزيم بواسطة ثابت التقارب كأ = ك1/ك−1 ثوابت ميكايليس هي كس = (ك2 + ك−1)/ك1 للركيزة و كص = (ك2 + ك−1)/ك−2 للمنتج. السرعة القصوى للتفاعل الأمامي هي الخامسالأعلى = ك2هتي، أين هتي هو المبلغ الإجمالي للإنزيم ، و ك2 هو ثابت المعدل الحفاز ، والذي يسمى أيضًا كقط.

الآن دعونا ندرس تأثير تغيير قيم ثوابت معدل معينة لإظهار أن سرعة التفاعل هي كمية قابلة للتحسين. النموذج الموضح في الشكل 1 أكثر تعقيدًا مما يبدو عليه ، لأنه يتضمن ستة معاملات مستقلة ، وأربعة ثوابت معدل وتركيزات S و P ، أو خمسة إذا كان يتعامل مع تفاعل كيميائي له ثابت توازن ثابت. وبالتالي ، لتقديم حالة بسيطة يمكن تحليلها بسهولة ، دعنا نصلح قيم بعض المعلمات بالإضافة إلى كمكافئ، قل س و ص (الركيزة وتركيزات المنتج) ، ك1 (وهو ثابت معدل ارتباط الركيزة الإنزيمية) ، و ك2 (والذي يتضمن ثوابت التحفيز وإطلاق المنتج). هذا الاختيار له معنى كيميائي واضح ، حيث أن كلا من ارتباط الإنزيم بالركيزة ومعدل التحفيز لهما حدود مفروضة بواسطة القيود الكيميائية للموقع النشط وهيكل الركيزة. وبالتالي ، يمكن تلخيص تطور الإنزيم نحو مجموعة مثلى من قيم ثوابت المعدل على النحو التالي.

دعونا نتخيل تسلسلًا افتراضيًا للخطوات التطورية لإنزيم بقيم ثابتة لـ ك1 و ك2 (انظر الشكل 2). في المرحلة الأولى ، يكون للإنزيم تقارب منخفض جدًا مع الركيزة ، مما يؤدي بوضوح إلى معدل تفاعل منخفض جدًا ، ثم يعمل التطور والانتقاء الطبيعي بعد ذلك ، مما يؤدي إلى تحسين تقارب الإنزيم مع الركيزة ، عن طريق تقليل ك−1. لأن ثابت التوازن للتفاعل كمكافئ = (ك1 · ك2)/(ك−1 · ك−2) ثابتة كما هي ك1 و ك2 في هذه الحالة ، انخفاض ك−1 يجب أن تكون مصحوبة بزيادة ك−2. هذا التأثير الأخير ، من حيث المبدأ ، غير ملائم للنشاط بأكمله ، ولكن نظرًا لأن المرحلة السابقة أسفرت عن معدل تفاعل منخفض جدًا ، فإن التأثير الإيجابي لانخفاض في ك−1 هو أكثر أهمية من السلبي لزيادة ك−2، وبالتالي فإن النتيجة العالمية هي أن المرحلة الثانية (الشكل 2) بها زيادة صافية في سرعة التفاعل. الآن دعونا نتخيل أن التقارب يزداد بالإضافة إلى ذلك من خلال المزيد من النقصان ك−1، التي تنطوي مرة أخرى على زيادة مقابلة قدرها ك−2. في هذه المرحلة ، تم زيادة تقارب الإنزيم مع ركائزه بشكل كبير ، ولكن بدلاً من تعزيز معدل التفاعل ، فإنه يقلل الآن من الكفاءة التحفيزية. السعر الذي يتعين على المرء دفعه مقابل هذا التقارب العالي للركيزة هو تقارب كبير للمنتج ، كما أن الإنزيم يربط الركيزة بإحكام ولكنه أيضًا يربط المنتج بإحكام. نظرًا لأن المنتج يتم تحريره ببطء فقط ، فإن النظام يعرض الآن سرعة رد فعل صافية ضعيفة. يوضح هذا المنطق البسيط أن قيمة ثابت التقارب لها قيمة مثالية للحصول على أقصى نشاط للإنزيم. بعبارة أخرى ، فإن الوظيفة الرياضية التي تربط سرعة التفاعل بمجموعة قيم ثابت معدل الإنزيم هي وظيفة قابلة للتحسين وبالتالي فهي هدف واضح للانتقاء الطبيعي.


ما الذي يسبب الارتفاع "الخاطئ" للعلامات الحيوية؟

ليست كل الارتفاعات في المؤشرات الحيوية للقلب تشير إلى نوبة قلبية.

يمكن أن ترتفع مستويات الكرياتين كيناز مع أي إصابة في العضلات ، أو مع تلف في الدماغ أو الرئتين ، أو مع أمراض الكبد أو الكلى.

الارتفاعات في مستوى الدم في تروبونين محددة تمامًا لتلف خلايا القلب ، لذلك بالمعنى الدقيق للكلمة ، لا يوجد شيء مثل الارتفاع "الخاطئ" للتروبونين. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث تلف لخلايا القلب لأسباب أخرى غير النوبة القلبية الحادة. قد تشمل هذه الحالات قصور القلب ، والتهاب عضلة القلب ، والرجفان الأذيني السريع ، وتعفن الدم ، وتشنج الشريان التاجي ، وتسلخ الأبهر ، واعتلال عضلة القلب الناتج عن الإجهاد ، أو الصمة الرئوية الشديدة.

لا يعتمد تشخيص النوبة القلبية على اختبار دم واحد ، بل يعتمد أيضًا على الأعراض السريرية ، وتغيرات تخطيط القلب ، و (غالبًا) على نمط من ارتفاعات العلامات الحيوية التي تشير إلى إصابة خلايا القلب الحادة.


تقييم قالب تمسخ الحمض النووي

يتم تنفيذ خطوة التمسخ الأولي في بداية PCR لفصل الحمض النووي للقالب مزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة بحيث يمكن للبادئات الارتباط بالمنطقة المستهدفة وبدء التمديد. يساعد التمسخ الكامل للحمض النووي المدخل على ضمان التضخيم الفعال للتسلسل المستهدف خلال دورة التضخيم الأولى. علاوة على ذلك ، تساعد درجة الحرارة المرتفعة في هذه الخطوة على تعطيل البروتياز أو النيوكليزات القابلة للحرارة التي قد تكون موجودة في العينة ، مع تأثير ضئيل على بوليميرات الحمض النووي القابلة للحرارة. عند استخدام بوليميراز DNA للبدأ الساخن ، تعمل هذه الخطوة أيضًا على تنشيط الإنزيم ، على الرغم من أنه قد يوصي مورد الإنزيم بخطوة تنشيط منفصلة.

عادة ما يتم تنفيذ خطوة التمسخ الأولي عند 94-98 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق. يمكن أن يختلف وقت ودرجة حرارة هذه الخطوة اعتمادًا على طبيعة قالب الحمض النووي وتركيزات الملح في المخزن المؤقت. على سبيل المثال ، قد يتطلب الحمض النووي الجيني للثدييات فترات حضانة أطول من البلازميدات ومنتجات PCR ، بناءً على تعقيد الحمض النووي وحجمه. وبالمثل ، فإن الحمض النووي الذي يحتوي على نسبة عالية من GC (على سبيل المثال ، gt65٪) غالبًا ما يتطلب فترة حضانة أطول أو درجة حرارة أعلى للتمسخ (الشكل 2). تحتاج المحاليل الوقائية ذات الأملاح العالية (كما هو مطلوب من قبل بعض بوليميراز الحمض النووي) عمومًا إلى درجات حرارة أعلى للتمسخ (على سبيل المثال ، 98 درجة مئوية) لفصل الحمض النووي مزدوج الشريطة (الشكل 3).

الشكل 2. زيادة وقت التمسخ الأولي يحسن العائد PCR لجزء 0.7 كيلو بايت غني بال GC تضخيم من عينة جدنا بشرية. تم ضبط خطوات التمسخ الأولي على 0 و 0.5 و 1 و 3 و 5 دقائق على التوالي.

بعض بوليميرات الحمض النووي مثل طق يمكن تغيير طبيعة بوليميراز الحمض النووي بسهولة من الحضانة المطولة فوق 95 درجة مئوية. للتعويض عن النشاط المنخفض في هذا السيناريو ، يمكن إضافة المزيد من الإنزيمات بعد خطوة التمسخ الأولي ، أو يمكن إضافة كمية أعلى من الموصى بها من بوليميريز الحمض النووي في البداية. الإنزيمات عالية الحرارة مثل تلك المشتقة من العتيقة قادرة على تحمل درجات الحرارة المرتفعة لفترات طويلة وتظل نشطة طوال فترة تفاعل البوليميراز المتسلسل (تعرف على المزيد حول خصائص بوليميريز الحمض النووي).


وصف موجز للبرنامج

يعمل البرنامج تحت Matlab 6.1 (The MathWorks Inc.، Natick، MA) على جهاز الكمبيوتر.

توليد البيانات التجريبية الزائفة -

يستخدم النموذج الذي يولد البيانات التجريبية الزائفة المعادلة التفاضلية 1 ، حيث كم هي دالة مستمرة للأس الهيدروجيني ، و كص هي دالة مستمرة للرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة والوقت لحساب التغيرات في نشاط الإنزيم في نموذج إنزيم ثنائي البروز مع ركيزة مؤينة ولتمسخ حرارة الإنزيم المعتمد على الوقت [9]. يتم إنشاء البيانات المقاسة الزائفة كنتيجة لتكامل المعادلة 1 للفترات الزمنية المحددة بواسطة المستخدم باستخدام وظيفة Matlab "ode15s". بالإضافة إلى الاعتماد المستمر على كم و كص على الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة ، يتم ضمان الطبيعة الحقيقية الزائفة للبيانات الناتجة عن طريق التضمين العشوائي لثلاثة أنواع من الأخطاء لكل تكرار للتجارب. تتم محاكاة الاختلافات البيولوجية لمستحضرات الإنزيم عن طريق الانحرافات النسبية الموزعة بالتساوي لـ كم و كص. تتم محاكاة أخطاء المجرب من خلال اختلافات موزعة بشكل طبيعي من هر و س0 التركيزات ، القيم النسبية التي تنخفض خطيًا مع زيادة هر و س0. يتم محاكاة الأخطاء في أجهزة أخذ العينات من خلال الاختلافات الموزعة بشكل طبيعي في ص، القيم النسبية التي تنخفض خطيًا مع زيادة لوغاريتم ص. وبالتالي ، يتم إنشاء البيانات المقيسة الزائفة بضوضاء مقبولة.

تحديد المعلمات الحركية -

يتم تحديد المعلمات الحركية من خلال تقليل البقايا المربعة في نموذج المعادلة 1 باستخدام البيانات المقاسة الزائفة ووظيفة Matlab "lsqnonlin."

تقدير توزيع المعلمات -

تتوفر طريقتان لتقييم توزيع المعلمات. يقوم إجراء مونت كارلو ببناء العينة الاصطناعية مع رسم عشوائي للبيانات من مجموعة موزعة بشكل طبيعي مع قيم متوسط ​​وتباين تتزامن مع القيم الخاصة بالعينة المقيسة الزائفة. ينشئ إجراء التمهيد عينة اصطناعية برسم عشوائي مع الاستبدال مباشرة من العينة المقيسة الزائفة (ينطبق فقط إذا كانت الأخيرة تحتوي على عدد كبير من النقاط). يتم تحديد مجالات الثقة على أساس مقياس التباين 2 كما نوقش أعلاه فيما يتعلق بالشكل 4 [10].

الرسومات والواجهة -

تُستخدم مرافق الرسومات في Matlab لتصور المحاكاة التجريبية. تسمح واجهة المستخدم الخاصة بالبرنامج بالدخول برقم تعريف شخصي فريد ، وبالتالي يتم تخزين الجلسات الفردية ، وإذا لزم الأمر يمكن للطلاب مواصلة عملهم في مناسبة لاحقة من المرحلة التي وصلوا إليها.

تعديل الظروف التجريبية للحالة المستقرة. أ، وهي تجربة لا يتم خلالها استيفاء حالة الاستقرار (ملف ES ينخفض ​​في النصف الثاني من فترة الحضانة المقيمة). ب، وهي تجربة تلبي متطلبات الحالة المستقرة. يمكن للطلاب التحقق بصريًا من صحة "المعايير" التجريبية لنموذج الحالة المستقرة (Δس & lt 0.1س0, هركم + س0) ، والتي يجب إثباتها بإجراءات رياضية معقدة [8].

الشروط العامة لعمل الإنزيم الأمثل. أ، المراقبة المستمرة لتوليد المنتج في سياق التفاعل المحفز بالإنزيم في درجات حرارة مختلفة. يوضح الفحص المستمر أيضًا الأخطاء الجوهرية في إجراء أخذ العينات التي تفرض ضرورة أخذ العينات المتكرر. ب، مقايسة نشاط إنزيم نقطة النهاية لأوقات أخذ العينات المختلفة. البيانات عبارة عن مقطع عرضي للمقايسة المستمرة في أ لمدة حضانة من 1 إلى 10 دقائق. توضح المقارنة بين المنحنيين الطبيعة الواضحة لدرجة الحرارة "المثلى" الناتجة عن الاعتماد الزمني لتمسخ الحرارة.

تحديد المعلمات مع تحليل الانحدار غير الخطي. أ، تحليل الانحدار غير الخطي للبيانات التجريبية بطريقة المربعات الصغرى. ب، نموذج الأخطاء التجريبية. يتم نمذجة اعتماد الانحراف المعياري (σ) كدالة لمتوسط ​​القيم المقاسة (μ).


شكر وتقدير

نحن ممتنون للأستاذة باتريشيا بوركهارت هولم لدعمها المستمر وتشجيعها. نشكر بيرند إيجر وأستريد بون وفيليب هيرش وباتريشيا بوركهارت هولم لقراءتهم النقدية للمخطوطة. نشكر Fabio Cortesi على تعليقاته الثاقبة ومركز علم الأحياء التطوري البحري لاستضافة خادم Blast ومتصفح الجينوم. تم توفير الموارد الحسابية بواسطة CESNET LM2015042 و CERIT Scientific Cloud LM2015085 ، المقدمة في إطار برنامج "مشروعات البنية التحتية للبحث والتطوير والابتكارات الكبيرة". نشكر Maria Leptin على تعليقاتها ونصائحها المفيدة أثناء شرح مكونات الجسيم الملتهب.

أذونات

تم اصطياد الأسماك المستخدمة في هذا العمل وفقًا للترخيص 2-3-6-4-1 من مكتب الكانتون للبيئة والطاقة ، بازل شتات.


شكر وتقدير

نحن ممتنون لألفارو كويفاس من شركة Hamilton Robotics لأمثلة وإرشاداته ومساعدته في الاستفادة من واجهة الشركة المصنعة للمعدات الأصلية (OEM) ، جنبًا إلى جنب مع باقي شركة Hamilton Robotics. نشكر جيسون يانج وستيفن فون ستيتينا وإيثان آلي وبريان وانج وسامانثا شيبرد وتيموثي إيربس والمراجعين الثلاثة على التعليقات والمناقشة العميقة. تم دعم EAD من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (F31 AI145181-01). تم دعم EJC من قبل زمالة Ruth L. Kirschstein NRSA من المعهد الوطني للسرطان (F32 CA247274-01). تم دعم هذا العمل من قبل MIT Media Lab ، وزمالة Alfred P. Sloan للأبحاث (إلى KME) ، وهدايا من Open Philanthropy Project ومؤسسة Reid Hoffman (إلى KME) ، والمعهد الوطني لأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R00 DK102669- 01 إلى KME) ، وصندوق Burroughs Wellcome Fund (IRSA 1016432 to KME) وبرنامج DARPA للجينات الآمنة (N66001-17-2-4054 ​​إلى KME). النتائج و / أو الآراء و / أو الآراء المعبر عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل الآراء أو السياسات الرسمية لوزارة الدفاع أو حكومة الولايات المتحدة.


شاهد الفيديو: الصف الحادي عشر المسار العلمي خصائص الإنزيمات وآلية عملها 1 (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Meztimi

    معذرةً ، لقد تم مسحها

  2. Tygonos

    ربما.

  3. Kagajinn

    نعم ، يبدو الأمر مغريًا

  4. Chepe

    هذه العبارة الرائعة ، بالمناسبة ، تتساقط

  5. Ammar

    فكرت وحذفت أفكاري

  6. Sigenert

    إذا كانت الفطر فقط تنمو في فمك ، فلن تضطر إلى الذهاب إلى الغابة على الأقل



اكتب رسالة