معلومة

الحد الأدنى لمقدار الحمض النووي الريبي لتحويل (كدنا) و qPCR

الحد الأدنى لمقدار الحمض النووي الريبي لتحويل (كدنا) و qPCR


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد بحثت في عدة بروتوكولات عن النسخ العكسي للـ RNA وتقترح جميعها استخدام تركيزات RNA تبلغ 1ug. هل يمكن أن يؤدي المبلغ الأقل إلى تمثيل نسخة أدنى وبالتالي انخفاض جودة نتائج qPCR؟

نستخدم مجموعة SensiFAST SYBR Lo-ROX من BIOLINE. كنت أفكر في استخدام 500ng بدلاً من 1000ng المقترح. من أجل استيعاب البروتوكول ، سأستخدم 0.5ul من RTase للحفاظ على نسبة 1: 1 (m / v). سأحتفظ بتركيزات المخزن المؤقت والدناز والماء و RTmix للتفاعل. من أجل التخفيف النهائي لـ (كدنا) ، سأخفف 5x بدلاً من 10x للحفاظ على تركيزات متساوية.

هل يملك احد خبرة في هذا؟ هل تمثيل النص يعاني؟ هل تبدو تعديلات البروتوكول المقترحة معقولة؟

شكرا للمساعدة مقدما.


جوابان يتبعان:

  1. الخبرة الفنية للكثيرين: يجب ألا تكون هناك مشكلة في أن يكون لديك نفس البروتوكول مع تركيز بدء منخفض مرتين ، دون إجراء أي تعديلات على الإطلاق. 1ug المقترح هو إلى حد كبير الجانب الأكثر أمانًا للأشياء ، ولا يحدث أي فرق تقريبًا في عدد 2 ضعف النصوص. ربما عند 1 أو 2 من حيث الحجم (10 إلى 100 ثانية) أقل ستواجه مشاكل أو تحتاج إلى تصحيح ردود أفعالك.

  2. العقيدة العلمية: أكثر النصائح العلمية التي يمكن لأي شخص تقديمها لك هي تجربتها في كلا الاتجاهين ومقارنة نتائجك باستخدام qRT-PCR. أعتقد أن كلا النهجين سيظهران نتائج متشابهة جدًا.


الحد الأدنى من كمية الحمض النووي الريبي لتحويل (كدنا) و qPCR - علم الأحياء

إرشادات حجم التفاعل لـ qPCR

تعد تقنية PCR في الوقت الحقيقي (qPCR) تقنية قوية لتحليل العينات لتحديد التسلسل المستهدف أو التعبير الجيني. يتم إجراء qPCR عادةً باستخدام تفاعلات تحتوي على قالب العينة ، والمزيج الرئيسي ، والأشعال الأمامية والعكسية ، وغالبًا صبغة مرجعية ROX ، مخففة في ماء درجة PCR. يعتمد حجم كل تفاعل على الظروف التجريبية ، لا سيما حجم الخزان في اللوحة أو النظام المستخدم. على سبيل المثال ، تستخدم 96 لوحة بشكل نموذجي تفاعلات 20-& mul ، وتستخدم 384 لوحة جيدة عادةً تفاعلات 10- & mul ، وعادةً ما تستخدم 1،536 لوحة جيدة تفاعلات 2 & mul ، وأنظمة عالية الإنتاجية ، مثل SmartChip Real-Time PCR System ، استخدام وحدات تخزين منخفضة تصل إلى 100 نل.

عادةً ، تُبلغ المجموعات والخلطات الرئيسية عن حجم المنتج بناءً على عدد التفاعلات. ومع ذلك ، كما نوقش أعلاه ، يمكن أن تختلف أحجام التفاعل ، مما يؤدي إلى اختلاف عدد التفاعلات من مجموعة معينة بناءً على حجم التفاعل المستخدم. يمكن أن يكون هذا أكثر تعقيدًا اعتمادًا على تركيز مزيج البداية الرئيسي (على سبيل المثال ، 2X ، 5X ، إلخ). للمساعدة في توضيح عدد التفاعلات التي يمكن الحصول عليها بالضبط من مجموعة معينة ، قدمنا ​​الجداول أدناه (مفصولة بناءً على نوع المنتج العام). يسرد كل منها رقم الكتالوج المحدد والحجم الإجمالي وتركيز المزيج الرئيسي المتضمن وعدد التفاعلات التي تم الحصول عليها باستخدام أحجام التفاعل المستخدمة بشكل متكرر.


جودة الحمض النووي الريبي

يمثل الحصول على العينة وتنقية الحمض النووي الريبي الخاص به الخطوة الأولى لكل مقايسة qRT-PCR ، ويمكن القول إن جودة القالب هي أهم عامل محدد لإمكانية التكاثر والأهمية البيولوجية لنتائج qRT-PCR اللاحقة. من المحتمل أن تكون قد نشأت هنا أي مشاكل تؤثر على إمكانية التكاثر ، وبالتالي أهمية النتائج. 7 العديد من العينات ، وخاصة خزعات الأنسجة البشرية ، فريدة من نوعها ، وبالتالي ، فإن إعداد الحمض النووي الضائع يعني أن فرصة تسجيل البيانات من تلك العينة تضيع بشكل لا رجعة فيه. هناك اعتبار منفصل يتعلق بإهدار المال ، حيث أن إحدى السمات المميزة لمقايسات PCR في الوقت الحقيقي هي تكلفة تشغيلها الفاحشة. لذلك من الحكمة بذل جهود مكثفة للحصول على كل مرحلة من هذه العملية بشكل صحيح تمامًا ، بدءًا من الاتساق عند جمع العينات ونقلها وتخزينها. يستمر هذا مع التقيد الصارم بالبروتوكولات عند استخراج الأحماض النووية ومع التخزين المناسب للمواد النقية ، يجب توخي الحذر المستمر في كل مرة يتم فيها إخراج العينة من التخزين للتحليل.

على عكس الحمض النووي ، الذي هو قاسٍ مثل الأحذية القديمة ، فإن الحمض النووي الريبي حساس للغاية بمجرد إزالته من بيئته الخلوية. لذلك ، فإن تنقيته أصعب بكثير من تنقية الحمض النووي ويجب أن يفي القالب المناسب للإدراج في اختبار RT-PCR بالمعايير التالية:

يجب أن تكون من أعلى مستويات الجودة إذا أريد للنتائج الكمية أن تكون ذات صلة.

يجب أن يكون خاليًا من الحمض النووي ، خاصةً إذا كان الهدف عبارة عن جين عديم النواة.

يجب ألا يكون هناك تكافؤ مشترك لمثبطات خطوة RT.

يجب أن يكون خاليًا من نوكلياز للتخزين الممتد.

تتعلق المشكلة الأكثر وضوحًا بتدهور الحمض النووي الريبي ، وأفضل طريقة لمعالجة هذه المشكلة هي الإصرار على تقييم جودة كل تحضير من الحمض النووي الريبي بدقة. يعتبر تقييم سلامة الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق فحص نطاقي الحمض النووي الريبي الريبوسومي 28S و 18S باستخدام الفصل الكهربائي للهلام طريقة مرهقة ومنخفضة الإنتاجية وتتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي الثمين. نوصي باستخدام نظام مثل Agilent & # x02019s (Palo Alto، CA) RNA LabChip و 2100 Bioanalyzer (الشكل 1 & # x200B 1). ). بالتأكيد ، من حيث التحليل الروتيني لأعداد كبيرة من مستحضرات RNA ، فهي إلى حد بعيد الطريقة الأكثر ملاءمة وموضوعية لتقييم جودة RNA. من الواضح أنه لا جدوى من ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات إذا كانت هذه الاختلافات ترجع ببساطة إلى تدهور عينة واحدة. تتضح أهمية استخدام الحمض النووي الريبي عالي الجودة من خلال النتائج الموضحة في الشكل 2 & # x200B 2.

تقييم جودة الحمض النووي الريبي. تُظهر هذه المؤامرات والمخطط الكهربائي 12 تحضيرًا من الحمض النووي الريبي المستخرج من خزعات القولون البشرية الطازجة. جودة هذه المستحضرات ، كما يُحكم عليها من خلال عدم وجود أي نطاقات أخرى غير 28S و 18S و 5S rRNA ، عالية جدًا.

أهمية فحص الحمض النووي الريبي عالي الجودة. أ: تم استخراج الحمض النووي الريبي من 19 خزعة قولونية جديدة باستخدام أعمدة Qiagen RNeasy (كراولي ، المملكة المتحدة) وتحليلها على Agilent Bioanalyzer باستخدام RNA LabChip. إعداد سليم الحمض النووي الريبي على اليسار يُظهر قمم الرنا الريباسي 18S و 28S بالإضافة إلى كمية صغيرة من 5S RNA. تدهور عينة RNA على حق ينتج تحولًا في توزيع حجم الحمض النووي الريبي نحو شظايا أصغر ونقصًا في إشارة التألق حيث يتم تدمير مواقع تقاطع الصبغة. حيث كشف هذا التحليل عن تدهور ، تم إعادة استخراج الحمض النووي الريبي من نفس العينة. تم إجراء فحوصات RT-PCR في الوقت الحقيقي لسبعة جينات مستهدفة ولكل عينة تم تقسيم رقم النسخة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي السليم على رقم النسخة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي المتدهور. إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي غير ذات صلة ، فمن المتوقع أن تكون نسبة الاثنين قريبة من 1 ، لأن هذه عينات متطابقة. إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي مهمة ، يجب أن تكون النسبة أكبر من 1 ، لأن رقم النسخة المحسوبة من الحمض النووي الريبي السليم يجب أن يكون أعلى من رقم النسخة من الحمض النووي الريبي المتدهور. ب: تظهر النتيجة بوضوح أن جودة الحمض النووي الريبي مهمة ، بالنسبة لبعض الجينات (على سبيل المثال ، IGF-I) أكثر من غيرها (IGF-IR). قد تكون النتيجة الشاذة التي تم الحصول عليها لـ GH بسبب البنية الثانوية لـ mRNA الخاص بها ، والتي يتم تقليلها عن طريق التحلل ، مما يجعلها أكثر سهولة في الوصول إليها. GAPDH ، Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase PCNA ، تكاثر مستضد الخلايا النووية GH ، هرمون النمو IGF-1 ، عامل النمو الشبيه بالأنسولين -1 1 & # x003b1-OH ، 1 & # x003b1-hydroxylase IGF-1R ، عامل نمو يشبه الأنسولين- 1 مستقبلات.

يتعلق السؤال الثاني بوجود مثبطات في تحضيرات قالب الحمض النووي الريبي. هناك العديد من المكونات داخل الدم والأنسجة التي يمكن أن تمنع اختبارات RT-PCR. دم الثدييات ، وخاصة مركب الهيم ، 8 معروف جيدًا باحتوائه على مثبطات اختبار PCR ، 9 ، 10 مع أقل من 1 ٪ v / v من الدم. طق بوليميراز. 11 حمض الهيوميك هو مثبط لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يتم إجراؤها على عينات مستخرجة من التربة ، 12 والمثبطات موجودة في الطعام ، 13 مع الكالسيوم أحد العوامل المهمة. 14 أحد الجوانب المهمة لأي تثبيط لمقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل هو أن هذا قد يضر بتفاعل البوليميراز المتسلسل كأداة تشخيصية. على سبيل المثال ، الأدوية التي تنتهي بالسلسلة ، مثل الأسيكلوفير المستخدمة في علاج الفيروسات الرجعية ، تثبط طق بوليميراز الحمض النووي ، مما ينتج عنه نتيجة سلبية خاطئة في بعض المرضى. يمكن أن تؤدي المستويات العالية من الحمض النووي الريبي المعتمد أيضًا إلى فشل مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم الإبلاغ عن 16 وسائط الثقافة ، ومكونات كواشف الاستخراج النووية ، 13 وحتى استخدام المسواك الخشبي لاختيار المستعمرات البكتيرية على أنها تمنع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). 17 أخيرًا وليس آخرًا ، يمكن أن تكون المثبطات انتقائية: تم الإبلاغ عن احتواء العضلات الهيكلية على مثبطات تثبط بوليميريز واحد& # x02014على سبيل المثال ، طق ، لكن لا ثيرموفيلوس بوليميراز. 18 يوضح الشكل 3 & # x200B 3 مثالاً على تثبيط مقايسة RT-PCR بواسطة الحمض النووي.

تقييم مثبطات في مستحضرات RNA. تم تحضير مزيج أساسي للاختبار باستخدام الخليط الرئيسي الرائع qRT-PCR المكون من خطوة واحدة (ستراتاجين) ، والذي يحتوي على خيط إحساس جيني نباتي ، وبادئات (200 نانومتر) ، ومسبار TaqMan المسمى FAM-BHQ (500 نانومتر) (النظم البيولوجية التطبيقية ، وارينجتون ، شيشاير ، المملكة المتحدة). تم تحضير إجمالي الحمض النووي الريبي من خزعات القولون الطازجة (5 مجم) باستخدام أعمدة Qiagen RNeasy وتم تعليقه في 80 & # x003bcL من المخزن المؤقت Tris-Cl / EDTA. تمت إضافة الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام) إلى الخليط الرئيسي للاختبار وتم إجراء اختبار RTPCR أحادي الأنبوب (الحجم النهائي 25 & # x003bcL ، 10 ساعات RT عند 50 & # x000b0C ، 40 دورة من 30 دقيقة عند 70 & # x000b0C) تم تنفيذه على Stratagene جهاز MX-4000 في الوقت الحقيقي PCR (أشرطة بيضاء). سبعة تضخمات تحكم تحتوي على الماء بدلاً من الحمض النووي الريبي (أشرطة سوداء) تم إعدادها وتشغيلها في نفس الوقت. سجلت معظم عينات الحمض النووي الريبي نفس Cر القيم كعناصر تحكم في المياه ، وكانت جميعها باستثناء ثلاثة ضمن 1 درجة مئويةر من السيطرة. ومع ذلك ، سجلت عينة واحدة درجة مئوية أعلى بكثيرر، مما يشير إلى أن هذا المستحضر يحتوي على مادة ملوثة. عند التخفيف ، سجلت هذه العينة نفس Cر كعينات التحكم (غير معروضة). جر، دورة العتبة.

من الواضح أنه لا توجد فائدة تذكر في تسجيل الفروق الزائفة في مستويات الرنا المرسال التي تستند ببساطة إلى وجود مثبطات في القوالب المختلفة التي تؤثر على اختبار RT أو اختبار PCR. تتمثل إحدى طرق تجنب ذلك في اختبار كل تحضير من الحمض النووي الريبي للمثبطات عن طريق تضخيم مجموعة أمبليكون ليس لها هوية تسلسلية مع أي تسلسل معروف داخل الحمض النووي الريبي المستهدف. على سبيل المثال ، إذا كان المرء يبحث في التعبير الجيني البشري ، فيمكن استخدام نبات أو أمبليكون اصطناعي لاختبار كل مستحضر من الحمض النووي الريبي للمثبطات. عمليًا ، يتضمن ذلك إعداد مزيج رئيسي يتضمن النبات أو الأمبليكون الاصطناعي ، وكلاهما من البادئات ، ومجموعة المسبار المحددة. المعيار جر (دورة العتبة) التي تميز هذا الفحص في حالة عدم وجود أي مثبط يتم تسجيلها عن طريق إضافة الماء إلى هذا المزيج الرئيسي (القالب المضاف & # x0201cno & # التحكم x0201d). هذا بمثابة نقطة مرجعية لـ Cر القيم التي تم الحصول عليها عند استبدال الماء بـ RNA المحضر من الخلايا أو الخزعات أو سوائل الجسم. في حالة عدم وجود المانع ، فإن Cر يبقى كما هو في وجود المانع ، Cر يزيد. هذا موضح في الشكل 3 & # x200B 3.

قد يُعتقد أن استخدام الجين المرجعي كعنصر تحكم داخلي يمكن أيضًا تحديد وجود المثبطات. قد يكون هذا ممكنًا بالنسبة للتجارب التي تشتمل على الحمض النووي الريبي المستخرج من خلايا زراعة الأنسجة ، على الرغم من أنه يتعين على المرء أن يُظهر أن الجين المرجعي المحدد المستخدم لا يتأثر بالظروف التجريبية. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب التي تنطوي على الخزعات ، فإن المشكلة في هذا النهج هي أن مستويات الرنا المرسال للجينات المرجعية تختلف اختلافًا كبيرًا بين الأفراد والأنسجة المختلفة. بدون معرفة مسبقة بمستويات الرنا المرسال في نسيج معين ، لا يمكن تحديد ما إذا كانت C منخفضة بشكل خاصر ناتج عن مثبط أو عن طريق مستويات منخفضة من الرنا المرسال المعين في تلك العينة. لذلك ، لا نوصي باستخدام الجينات المرجعية لهذا الغرض.

من الناحية التاريخية ، تم استخدام ما يسمى بجينات التدبير المنزلي ، والتي يُعتقد أنها معبر عنها بشكل أساسي ومنظم إلى الحد الأدنى ، على نطاق واسع كمراجع داخلية للحمض النووي الريبي للنشاف الشمالي وحماية RNAse والتحليلات النوعية لـ RT-PCR. تظل مستخدمة على نطاق واسع كجينات مرجعية (عناصر تحكم داخلية) للتحليل الكمي في مقايسات RT-PCR في الوقت الفعلي ، عادةً دون أي تحقيق حقيقي حول مدى ثبات مستويات mRNA الخاصة بهم بالفعل في ظل الظروف التجريبية التي يتم التحقيق فيها. خلص تحليل منهجي حديث ومقارنة لفائدتها على خزعات الأنسجة في الجسم الحي إلى أنه لا ينبغي استخدام جين واحد للتدبير المنزلي للتطبيع. 19 يبدو من المعقول افتراض أن معظم الجينات منظمة وأن هذا سيؤدي إلى اختلافات كبيرة غير متوقعة في أنماط تعبيرها بين وحتى داخل الفرد نفسه. إذا كان سيتم استخدام جينات التدبير المنزلي ، فيجب التحقق من صحتها للإعداد التجريبي المحدد وربما يكون من الضروري اختيار أكثر من & # x02014 كما تم القيام به ، على سبيل المثال ، لتنميط التعبير عن تمايز الخلايا المساعدة T. تم وصف المشكلات المرتبطة باختيار الجينات المرجعية المناسبة مؤخرًا بطريقة واضحة وموثوقة ، حيث أوصى المؤلفون باستخدام المتوسط ​​الهندسي للجينات المرجعية المتعددة المختارة بعناية للتطبيع. 21 يقدم هؤلاء المؤلفون بشكل مفيد برنامجًا يساعد في اختيار الجينات المرجعية الأكثر ملاءمة.


مقدمة في تسلسل الحمض النووي الريبي

يعد التعبير الجيني عملية مدروسة على نطاق واسع ومجال رئيسي للتركيز على علم الجينوم الوظيفي [1]. يهتم التعبير الجيني بتدفق المعلومات الجينية من قالب الحمض النووي الجيني إلى منتجات البروتين الوظيفية (الشكل 1). أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي المتوازي بشكل كبير (RNA-seq) مقايسة قياسية للتعبير الجيني ، خاصة لاستجواب وفرة النسخ النسبية والتنوع. أكدت العديد من الدراسات أن دقة القياس الخاصة بها تنافس تلك الخاصة بالطرق الأخرى الراسخة مثل المصفوفات الدقيقة وتفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (qPCR) [2-4]. تم الإبلاغ عن أن 85٪ من أحداث الربط الجديدة و 88٪ من exons المعبر عنها تفاضليًا التي تنبأ بها RNA-seq يتم التحقق منها من خلال مناهج "المعيار الذهبي" مثل النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) و qPCR [3].

يتم تصوير تدفق المعلومات الجينية من قالب الحمض النووي الجينومي مزدوج الشريطة إلى البروتينات المعدلة بعد الترجمة بخصائص جزيئية مهمة لكل مرحلة تم تعدادها. يستهدف RNA-seq عادةً جزيئات mRNA الناضجة. الاختصارات: موقع لصق المتبرع (D) موقع لصق متقبل (A) متعدد الأدينيل (بولي (A)) موقع لصق المنطقة غير المترجمة (UTR) (SS) محسن الربط الخارجي (ESE) ، كاتم صوت الربط الخارجي (ESS) ، محسن الربط الداخلي (ISE) ) كاتم صوت الربط الداخلي (ISS).

تتكون طريقة RNA-seq عادةً من تحديد العينات البيولوجية المناسبة (والنسخ المتماثلة) ، وعزل إجمالي RNA ، وإثراء RNAs nonribosomal ، وتحويل RNA إلى cDNA ، وإنشاء مكتبة مجزأة ، والتسلسل على منصة تسلسل عالية الإنتاجية ، وتوليد من القراءات الفردية أو المزدوجة من 30 إلى 300 زوج أساسي في الطول ، ومحاذاة أو تجميع هذه القراءات ، والتحليل النهائي (الشكل 2) [5،6]. هناك العديد من أهداف التحليل النهائية التي تناسب RNA-seq. يتضمن ذلك اكتشاف النص [7-11] ، شرح الجينوم [8،12،13] ، دراسة آليات تنظيم الجينات [14] ، تحليل التعبير الجيني التفاضلي [15-17] ، تحليل التعبير البديل [3] ، خاص بالأليل تحليل التعبير [18،19] ، الكشف عن تعديل الحمض النووي الريبي [20-22] ، الكشف الفيروسي [23-25] ، كشف الاندماج الجيني [26-30] ، وأنواع أخرى من اكتشاف المتغيرات [31-33]. يوفر الجدول S1 ملخصًا أكثر تفصيلاً لتطبيقات تحليل RNA-seq ، ويسرد جدول S2 الأدوات ذات الصلة بكل منها (ترد الاستشهادات الإضافية للجداول التكميلية في نص S1). بالإضافة إلى هذه التطبيقات المحددة ، أتاح RNA-seq اكتشافات مهمة في مجالات بحثية متعددة. تتضمن هذه الاكتشافات اكتشافات الاندماج في السرطان [34-36] ، وفهمًا أكبر لانتشار وآليات وتنظيم التضفير البديل [37-39] ، وتحسين فهم الانتشار والأهمية الوظيفية لجينات الحمض النووي الريبي غير المشفر [40،41] ، تقدير متزايد (لكن مثير للجدل) لانتشار تحرير الحمض النووي الريبي [21] ، وأكثر من ذلك بكثير. يتم أيضًا تحويل RNA-seq بنشاط إلى التطبيقات السريرية في العديد من الأمراض البشرية [42 ، 43]. في حين أن RNA-seq هو نهج قوي للعديد من الأسئلة البيولوجية [44] ، إلا أن القيود والمحاذير المعروفة لمقايسات تعبير RNA السابقة مثل المصفوفات الدقيقة لا تزال قابلة للتطبيق [2]. يتضمن ذلك القيود التي تمثلها تجربة تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) فقط لقطة واحدة لإخراج التعبير عن الحالة المستقرة لمجموعة من الخلايا [45] وأن تعبير الحمض النووي الريبي لا يرتبط دائمًا بتعبير البروتين ، فضلاً عن القيود الأخرى [46 ، 47].

يتضمن سير العمل التجريبي النموذجي لـ RNA-seq عزل RNA من عينات الاهتمام ، وإنشاء مكتبات التسلسل ، واستخدام مُسلسِل عالي الإنتاجية لإنتاج مئات الملايين من القراءات القصيرة المزدوجة النهاية ، ومحاذاة القراءات مقابل الجينوم المرجعي أو النسخ. ، والتحليل النهائي لتقدير التعبير ، والتعبير التفاضلي ، واكتشاف الشكل الإسوي للنسخ ، والتطبيقات الأخرى. ارجع إلى جدول S1 وجدول S3 وجدول S7 لمزيد من التفاصيل حول المفاهيم الموضحة في هذا الشكل.

في هذه المقالة التعليمية ، نستكشف مفاهيم البيولوجيا الجزيئية لـ RNA-seq التي تؤثر على سير عمل تحليل RNA-seq وتفسير البيانات. كما نقدم مقدمة مفصلة للمفاهيم المعلوماتية الأساسية لـ RNA-seq وأسئلة التحليل الشائعة. يتم تغطية هذه المفاهيم هنا ، في المواد والمحاضرات التكميلية المتاحة على www.rnaseq.wiki ، ومقاطع الفيديو الخاصة بهذه المحاضرات متاحة على http://bioinformatics.ca/workshops/. أخيرًا ، نوفر برامج تعليمية مفتوحة الوصول تغطي الحوسبة السحابية لتحليل RNA-seq ، وتثبيت الأداة ، وتنسيقات الملفات ذات الصلة ، والجينومات المرجعية ، والتعليقات التوضيحية للنسخة ، ومراقبة الجودة ، وخطوط الأنابيب الكاملة للتعبير ، والتعبير التفاضلي ، وتحليل الربط البديل (إضافي دروس عبر الإنترنت على www.rnaseq.wiki). تمثل البرامج التعليمية مثالاً لسير عمل RNA-seq استنادًا إلى مجموعة "tuxedo" [15] والأدوات الأخرى الشائعة الاستخدام. تم اختيار هذه الأدوات التمثيلية من بين العديد من البدائل الممكنة لتقديم المفاهيم الأساسية لكل خطوة تحليل (جدول S2). تم تصميم البرامج التعليمية للعمل في بيئات نظام التشغيل Mac OS و Linux و Amazon Web Services (AWS) Elastic Compute (EC2) وتكون مصحوبة بمجموعات بيانات الاختبار المتاحة للأغراض التعليمية (www.rnaseq.wiki).


مناقشة

تشير بياناتنا إلى أن الحمض النووي الريبي قد ينتقل جسديًا من نسيج جسدي في ذكور الفئران ، وفي هذه الحالة الدماغ ، إلى السلالة الجرثومية والأجنة اللاحقة. من المحتمل أن تكون طريقة نقل الحمض النووي الريبي عبر اللمف ومجرى الدم عبارة عن حويصلات ، مما يوفر بيئة آمنة لتجنب التدهور وزيادة الاستقرار [32 ، 33]. على الرغم من أننا لم نتمكن من العثور إلا على حالة واحدة حيث قام نظام الكشف الخاص بنا بالتقاط الحمض النووي الريبي في الأجزاء المحتوية على الحويصلة من الدم الكامل فائق التركيز (ملف إضافي 10: الشكل S9) ، فقد يعمل هذا فقط على إبراز قيود الكشف الحالية. لذلك ، لا يمكننا تأكيد الحدوث الدقيق لأننا قد لا نلتقط جميع العينات الإيجابية ، لأن تصميمنا التجريبي فرض عن قصد مستوى منخفض من العدوى الفيروسية حتى لا يغمر النظام الداخلي. ومع ذلك ، فإن البيانات المجمعة من كل من 8 و 16 أسبوعًا من الذكور بعد الحقن والأجنة الخاصة بهم لا تزال تظهر معدل توريث بنسبة 33 ٪. علاوة على ذلك ، فإن تحققنا الشامل وتحديدنا الكمي لـ qPCR الإيجابية ينتج عن العديد من الحيوانات والأطر الزمنية ، جنبًا إلى جنب مع ضمان أن الفيروس لا يفلت من الدماغ ، يقودنا إلى الاستنتاج بثقة أن هذه العملية تحدث بالفعل على الأقل في الماوس. لقد وجدنا اتجاهًا نحو التعبير العام الأعلى في مواقع الحقن في الدماغ (عند 8 أسابيع) ومعدلات وراثية أعلى (8 أسابيع - 50٪ ، 16 أسبوعًا - 28٪ ملف إضافي 11: الشكل S10) على الرغم من أن هذا مجرد الارتباط في هذه المرحلة. كانت دراستنا محدودة من حيث أننا استخدمنا نظامًا نموذجيًا واحدًا و RNA صغيرًا واحدًا. يجب أن تحقق التجارب المستقبلية في RNAs ذات الأحجام والتسلسلات المختلفة ، إلى جانب أنظمة الكشف البديلة مثل التسلسل العميق والتهجين في الموقع. ومع ذلك ، إذا تم التحقق من نتائجنا في دراسات لاحقة ، فإن إثبات أن ثلث الأجنة يحتوي على نسخة MIR941 بعد 8 و 16 أسبوعًا بعد الحقن يشير إلى أن نقل الحمض النووي الريبي يعكس آلية ذات مغزى للتأثيرات اللاجينية بين الأجيال ويضع الأساس للقياسات المباشرة من مدى الوراثة الجسدية القائمة على الحمض النووي الريبي في الأنواع المختلفة.


 قراءة الطول وعمق التسلسل

معيار mRNA- أو إجمالي RNA-seq: تُستخدم قراءات أحادية الطرف 50 أو 75 نقطة أساس في الغالب لتنميط التعبير الجيني العام. لدراسة متغيرات الربط البديلة ، غالبًا ما يتم طلب قراءات ذات نهايات مزدوجة أطول (تصل إلى 150 نقطة أساس). على عمق التسلسل ، عادة ما تكون 20-25 مليون قراءة لكل عينة مناسبة للتنميط العام للتعبير الجيني ، بينما يُقترح 40-50 مليون قراءة لاكتشاف متغير التضفير.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية: بالنسبة إلى مكتبات تسلسل scRNA المعدة يدويًا ، نوصي بالحصول على 1-2 مليون قراءة أحادية الطرف 50-75 نقطة أساس لكل خلية. هذا العمق كافٍ بشكل عام لتحديد النصوص ذات الوفرة المنخفضة. بالنسبة للمكتبات التي تم إعدادها باستخدام نظام 10x Genomics Chromium ، تقترح الشركة عمق تسلسل يبلغ 50000 قراءة لكل خلية ، وطول قراءة نصية يبلغ 98 نقطة أساس.

تسلسل RNA-seq منخفض المدخلات أو المدخلات المنخفضة للغاية: يظل طول القراءة كما هو في mRNA القياسي أو إجمالي RNA-seq. قد يتم تقليل عمق التسلسل إلى حد ما بناءً على كمية مادة البداية.

تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير: يولد NUSeq قراءة أحادية الطرف 50 أو 75 نقطة أساس لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير. عمق التسلسل المقترح هو 4-5 مليون قراءة لكل عينة.

 طلب خدمة

استشارة المشروع مجانية. يمكن طلب خدمات RNA-seq من خلال NUcore.

 تقديم عينة

يأخذ NUSeq إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج لـ RNA-seq (لا توجد أنسجة أو خلايا ، باستثناء خلية واحدة RNA-seq - انظر أدناه). جودة الحمض النووي الريبي هي العامل الوحيد الأكثر أهمية الذي يحدد النتيجة النهائية. بعد إسقاط العينة ، يقوم الموظفون الأساسيون بإجراء عينة مراقبة الجودة ، والتي تتضمن قياس تركيز Qubit وتوليد رقم تكامل الحمض النووي الريبي (RIN) القائم على التحليل البيولوجي ، قبل إنشاء المكتبة. مطلوب RIN من 7 للمضي قدما في بناء مكتبة mRNA-seq. يجب أيضًا أن تكون عينات الحمض النووي الريبي المقدمة خالية من الحمض النووي ونقترح دائمًا تضمين خطوة معالجة DNase أثناء استخراج الحمض النووي الريبي. إن وجود تلوث الحمض النووي الجيني مرئي على آثار Bioanalyzer في حدود 4-10 كيلو بايت.

في الحالات التي يكون فيها تدهور الحمض النووي الريبي أمرًا لا مفر منه ، كما هو الحال عند استخدام أنسجة FFPE ، يُقترح إجمالي RNA-seq لأنه أقل اعتمادًا على سلامة الحمض النووي الريبي.

بالنسبة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، يبدأ الموظفون الأساسيون من الخلايا المستهدفة لبناء المكتبة. يرجى الرجوع إلى النواة أولاً قبل إعداد العينة للحصول على أفضل أداء.

 المعلوماتية الحيوية

يتم توفير تحليل البيانات عند الطلب. تتضمن خدمة المعلومات الحيوية القياسية RNA-seq تسلسل البيانات ومراقبة الجودة والمحاذاة والتطبيع وتحليل التعبير التفاضلي. تعرف على المزيد حول خدمات المعلوماتية الحيوية.


أساليب

تحضير الخلايا وزرعها

تم تحضير جزر البنكرياس من فئران سليمة من المعهد الوطني للبحوث البحرية (NMRI) تتراوح أعمارها بين 3 و 4 أشهر (Bomholtgaard) وتم إطعامها نظامًا غذائيًا طبيعيًا. تم التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، وعُزلت جزر البنكرياس عن طريق هضم كولاجيناز P (روش) متبوعًا بالجمع اليدوي للجزر الصغيرة [36]. لتحضير خلايا مفردة مشتتة ، تم اهتزاز الجزر المجمعة برفق عند تركيز Ca 2+ خارج الخلية منخفض لإذابة بنية الجزيرة الصغيرة [37]. تم طلاء الخلايا المشتتة في أطباق بتري بلاستيكية 35 مم (Nunc) في وسط RPMI 1640 (SVA) مكمل بـ 10 ٪ FCS ، و 100 U مل -1 بنسلين ، و 10 ميكروغرام -1 ستربتومايسين (كلها من Invitrogen) في وجود 5 ملي مولار. الجلوكوز (سيغما الدريش). تم الاحتفاظ بالخلايا في المزرعة لمدة 2-6 ساعات ، مما يسمح لها بالالتصاق بسطح الطبق

تم تحضير الخلايا النجمية الأولية واستزراعها كما هو موصوف [38]. نمت الخلايا في وسط Dulbecco المعدّل لـ Eagle (Sigma-Aldrich) الذي يحتوي على 10 ٪ من مصل العجل الجنيني ، 2 مليمول / لتر L- الجلوتامين ، والبنسلين الستربتومايسين (جميع Invitrogen).

مجموعة خلية واحدة

تم غسل الخلايا المرفقة المشتتة مرتين باستخدام محلول مؤقت (يشار إليه باسم محلول خارج الخلية ، EC) يحتوي على 138 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 5.6 ملي مول كلوريد ، 1.2 ملي مول كلوريد2، 2.6 ملي كلوريد الكالسيوم2، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم) و 3 أو 6 أو 10 أو 20 ملي جلوكوز لإزالة الحطام الميت والسائق قبل تجميع الخلايا باستخدام ماصات ملزمة. تم تركيب الطبق ، الذي يحتوي على خلايا ملتصقة وحوالي 1 مل من محلول EC ، في مجهر ضوئي مقلوب قياسي (Zeiss Axiovert 135). تم سحب الشعيرات الدموية المصنوعة من زجاج البوروسيليكات (Hilgenberg GmbH) بقطر خارجي يتراوح من 1.5 إلى 1.6 مم وسمك جدار يبلغ 0.16 مم إلى الماصات باستخدام مجتذب ماصة ملقط (Heka PIP5). كان قطر الطرف حوالي 10 ميكرون في المتوسط ​​، وهو أوسع بكثير من ماصات المشبك القياسية وكبير بما يكفي للسماح بمرور خلية سليمة. تم تركيب الماصة الزجاجية على معالج دقيق هيدروليكي (ناريشيجي) على المجهر. من خلال التحكم يدويًا في الضغط داخل الماصة ، كان من الممكن جمع الخلايا السليمة أو شبه السليمة مع الحد الأدنى من حجم المحلول خارج الخلية (& lt & lt 0.1 ميكرولتر). في المجموع ، تم جمع 158 خلية ، وتم تحديد 126 (80٪) على أنها خلايا بيتا بناءً على تعبيرها عن الأنسولين بينما كانت معظم الخلايا المتبقية عبارة عن خلايا ألفا (16٪). كانت ست عينات سلبية لجميع الجينات المقاسة وتم تصنيفها على أنها إخفاقات فنية (معدل نجاح 96٪).

تحلل وتنقية

تحلل الكتلة الخلوية

تم وضع جزر البنكرياس المفردة من نفس الحجم تقريبًا في 10 ميكرولتر من مخازن تحلل مختلفة. تم استخدام المنظفات Nonidet P-40 (NP-40 ، والمعروفة أيضًا باسم Igepal CA-630 ، Sigma-Aldrich) و guanidine thiocyanate (GuSCN ، Sigma-Aldrich). تم تحضين العينات عند 60 درجة مئوية أو 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (60 درجة مئوية للعينات التي تحتوي على 0.4 مجم / مل من بروتيناز K (Invitrogen)) متبوعًا بحضانة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتم تجميدها عند -25 درجة مئوية لتحليلها لاحقًا . تم تخفيف العينات بنسبة 1:20 باستخدام ماء mQ (ELGA Labwater) قبل النسخ العكسي.

تم غسل الخلايا النجمية الأولية مرتين في برنامج تلفزيوني متبوعًا بتفكك خلية واحدة مع علاج التربسين / EDTA (Invitrogen) بنسبة 0.25 ٪ لمدة 3 دقائق. تم تعطيل التربسين عن طريق إضافة وسط الخلية وغسله مرة واحدة في برنامج تلفزيوني. تم بعد ذلك ترشيح الخلايا باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر (بيكتون ديكنسون). تم توزيع الخلايا بالتساوي بين أنابيب العينات وتم التخلص من جميع السوائل بعد طرد مركزي قصير (3000 جم لمدة دقيقة واحدة) متبوعًا بإضافة 50 ميكرولتر من محلول تحلل. تم استخدام 2 U / ميكرولتر RNaseOut (Invitrogen) كمثبط RNase. تم تحضين العينات عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم تجميدها عند -25 درجة مئوية لتحليلها لاحقًا. تم تخفيف العينات بنسبة 1: 4 باستخدام ماء mQ قبل النسخ العكسي.

تحلل الخلية الواحدة

في التجارب أحادية الخلية ، تم إفراغ الماصات الزجاجية في أنابيب بلاستيكية بحجم 0.2 مل تحتوي إما على 2 ميكرولتر من 0.5 مولار من GuSCN أو 1 ميكرولتر من 1 M GuSCN في الماء. تطلب التفريغ جهازًا مصنوعًا حسب الطلب يتكون من حامل أنبوب مصطف مع معالج دقيق خشن تم تركيب الماصة عليه. تم شطف الماصة الزجاجية بعناية بمحلول تحلل عدة مرات للتأكد من دخول الخلية في الأنبوب. في معظم الحالات ، تم كسر طرف الماصة برفق في الأنبوب مما يسهل تنظيف الماصة. تم بعد ذلك تجميد الأنابيب على الفور على الجليد الجاف (-78 درجة مئوية) وتخزينها عند -80 درجة مئوية للنسخ العكسي اللاحق. لم يؤثر التخزين قصير المدى على الجليد الرطب (0 درجة مئوية) على التحلل أو أداء التفاعل اللاحق.

إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي

تمت تنقية إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام GenElute Mammalian Total RNA Kit (Sigma-Aldrich) أو RNeasy Mini Kit (Qiagen) وتم قياس التركيزات باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000 (تقنيات Nanodrop).

النسخ في المختبر

تم إنشاء عنصر تحكم RNA صناعي باستخدام نظام النسخ المختبري T7 RNA Polymerase (Takara). اختبار PCR للسيكلوفيلين E (Ppie) كقالب للنسخ في المختبر. Ppie تم إنشاء منتج PCR باستخدام البروتوكول كما هو الحال بالنسبة لمقايسات PCR في الوقت الفعلي المستندة إلى SYBR Green (انظر أدناه) ، باستثناء أنه تم استبعاد جميع مركبات الفلور وتنقيتها باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR (Qiagen). تم بعد ذلك تضخيم منتج PCR باستخدام التمهيدي PCR الممتد بما في ذلك تسلسل المروج لـ T7 RNA Polymerase. تم العثور على جميع تسلسلات التمهيدي في الملف الإضافي 1: الجدول 3. تمت تنقية منتج PCR الناتج (الممتد) على النحو الوارد أعلاه واستخدامه في تفاعل النسخ في المختبر ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. احتوى خليط التفاعل على: 50 U T7 RNA polymerase ، 40 ملي مولار Tris-HCl (pH 8.0) ، 8 ملي MgCl2، 2 ملي سبيرميدين ، 5 ملي ديثيوثريتول (جميع تاكارا) ، 2 ملي مولار NTP (Invitrogen) ، 20 U RNaseOut (Invitrogen) و

40 نانوغرام قالب DNA. تم إجراء التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة). في العينات التي تحتوي على

2000 نسخة من Ppie RNA ، كان متوسط ​​معامل التباين داخل المقايسة 0.3٪ والتباين بين المقايسة 1.2٪.

RT-PCR الكمي

بسبب التقلبات العشوائية ، نسبيا توفر مستويات التعبير الجيني القليل من المعلومات ، تاركة القياس الكمي المطلق باستخدام المنحنيات القياسية كخيار أفضل لمقارنة مستويات النسخ داخل الخلايا وفيما بينها. لجميع المقايسات ، تم تنقية منتجات PCR (مجموعة تنقية QIAquick PCR ، Qiagen) وقياس الطيف الضوئي الكمي (NanoDrop ND-1000) باستخدام قيم الامتصاصية المولية التالية (في الشامات -1 سم -1): dAMP ، 15200 dTMP ، 8400 dGMP ، 12010 dCMP، 7050. تم تخفيف منتجات PCR على التوالي لتوليد منحنى قياسي يتراوح من 10-10 6 نسخ مع كفاءة PCR تمتد 77-95٪ (ملف إضافي 1: الشكل 3). تم إجراء تحليل بيانات qPCR بشكل أساسي كما هو موصوف [9]. نظرًا لأن منتجات PCR مزدوجة الشريطة و cDNA مفردة تقطعت بهم السبل ، فقد تم طرح دورة واحدة من قيم Ct أحادية الخلية من أجل القياس الكمي المطلق الصحيح.

تم استخدام النسخ العكسي SuperScript III (Invitrogen) طوال فترة الدراسة. 6.5 ميكرولتر تحتوي على إجمالي الحمض النووي الريبي أو الخلايا المفردة المتحللة ، 0.5 ملي dNTP (Sigma-Aldrich) ، 2.5 ميكرومتر أوليغو (dT) (15 نقطة أساس ، Invitrogen) ، 2.5 ميكرومتر من hexamers العشوائية (Invitrogen) حضنت عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضفنا بعد ذلك 50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.3) ، 75 ملي مولار بوكل ، 3 ملي مولار MgCl2، 5 ملي ديثيوثريتول ، 20 يو RNaseOut و 100 ، 40 أو 10 يو (كمية أقل للعينات أحادية الخلية) SuperScript III (جميع Invitrogen) لحجم إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر. تظهر تركيزات التفاعل النهائي. كانت ملامح درجة الحرارة المستخدمة 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 50 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة. تم إنهاء جميع التفاعلات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في هذه الورقة ، نشير إلى أرقام النسخ المطلقة المقدرة بواسطة المنحنيات المعيارية المستندة إلى الحمض النووي بافتراض كفاءة RT بمقدار ≤ 100٪ ، والعدد الحقيقي لنسخ mRNA يساوي أو أعلى من تقديرنا.

تم استخدام نظام اكتشاف التسلسل ABI PRISM 7900 HT (النظم البيولوجية التطبيقية) و LightCycler 480 (Roche Diagnostics) المجهز بـ 384 كتلة بئر لقياسات qPCR. ردود الفعل (10 ميكرولتر) مع SYBR Green كمراسل فلوري يحتوي على 10 ملي مولار تريس (الرقم الهيدروجيني 8.3) ، 50 ملي مول كلوريد ، 3 ملي MgCl2، 0.3 مم dNTP ، 1 U JumpStart Taq polymerase ، 1 × صبغة مرجعية (جميع Sigma-Aldrich) ، 0.5 × SYBR Green I (Invitrogen) و 400 نانومتر من كل مادة أولية (TAGC Copenhagen). تم استبعاد الصبغة المرجعية باستخدام LightCycler 480. تم استخدام iQ ™ SYBR ® Green Supermix (BioRad) في متنوع فحص. تتوفر تسلسلات التمهيدي في ملف إضافي 1: الجدول 3. تم تصميم جميع فحوصات qPCR باستخدام Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi وامتدت على الأقل intron واحدًا عندما يكون ذلك ممكنًا. تم تحسينها بحيث لا تنتج أي منتجات غير محددة ، مثل الثنائيات الأولية ، التي يمكن أن تتداخل مع القياس الكمي للهدف المطلوب. تم تأكيد تكوين نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقعة بواسطة الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز (2٪) لجميع المقايسات ، وتحليل منحنى الذوبان لجميع العينات.

بالنسبة لحسابات ضوضاء RT-qPCR ، تم استخدام RT-qPCR 24 طية على الحمض النووي الريبي المخفف لجزيرة الماوس الكلي المنقى وتفاعلات qPCR ذات 30 طبقة على إجمالي جزيرة cDNA.

تحليل ضوضاء RT-qPCR

يعتمد النموذج النظري على توصيف تجريبي للضوضاء في التجارب. أولاً ، نعتبر الضوضاء في تفاعل qPCR فقط ونحدد كيفية قياسها كدالة لعدد cDNAs بناءً على التكرارات التي تم تخفيفها بدرجات مختلفة. يُفترض أن تكون ضوضاء qPCR هي نفسها لجميع الجينات. لنمذجة ضوضاء RT ، يتم تركيب معلمة لكفاءة RT من مكررات تم تخفيفها إلى درجات مختلفة. باستخدام معلماتنا المحددة تجريبياً للنموذج ، يمكننا حساب مساهمات RT و qPCRs ويمكن مقارنة ضوضاء القياس الإجمالية بالتغير البيولوجي في مجموعة من الخلايا. يوجد وصف كامل للنموذج في ملف إضافي 2.


PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) هو أسلوب شائع الاستخدام لتحليل مستوى التعبير الجيني النسبي في البحث الطبي الحيوي. في معظم الحالات ، تم تصميم التجارب الصغيرة لتحديد مستوى الرنا المرسال بين الظروف التجريبية. Some advanced machines and optimized protocols have simplified the experiments to a highly efficient one-step process, allowing the effective analysis of a large scale of qPCR data. However, all processes for assessing the quality of the data, performing the analysis and reporting the results are not done in the most uniform way across the literature (Bustin & Nolan, 2004). Different analysis models have been proposed and implemented in different software environments (Pabinger et al., 2014). Furthermore, requirements and guidelines for reporting qPCR data were independently introduced (Bustin et al., 2009).

In this report, we introduce an open source R package for performing quality assessment, modeling and testing for statistical significance of qPCR data in a uniform way. In its current version, the pcr package implement two methods for relative quantification of mRNA expression proposed originally by Livak & Schmittgen (2001), in addition to the necessary steps to check the assumption of these methods. Also, we implement a number of methods to check for statistical significance in qPCR data which were introduced in SAS by Yuan et al. (2006). Finally, the package provides unified interface to make the analysis accessible and the ability to make graphs of the different analysis steps for visual inspection and preparation of publication-level figures. We start by describing the process for generating the data in the original papers, briefly introduce the methods and apply them to the original data using the pcr.


SYNOPSIS

  • ‘CRISPR integrated gRNA and reporter sequencing’ (CIGAR-seq) is a new high-throughput method for unbiased screening of mRNA modification regulators.
  • The study presents the first pooled CRISPR screen with epitranscriptomic readout.
  • NSUN6 is discovered as a novel mRNA m 5 C methyltransferase.
  • NSUN6 and NSUN2 contribute to almost all the m 5 C modification in mRNA.


شاهد الفيديو: Ekstraksi RNA Sintesis cDNA (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Voodoolkis

    انت مخطئ. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنناقش.

  2. Sakus

    مع هذا المقال ، أبدأ في قراءة هذه المدونة. بالإضافة إلى مشترك واحد

  3. Samutilar

    في حالة وجود أزمة ، أقوم بتخزين الحساء ، الذي أوصي به للجميع

  4. Ken'ichi

    الجواب الرائع :)

  5. Ethyn

    شكرًا لك ، المنشور مكتوب بشكل معقول وإلى هذه النقطة ، هناك شيء يجب تعلمه.

  6. Keiji

    في هذا الشيء هو فكرة ممتازة. وهي على استعداد لدعمكم.



اكتب رسالة