معلومة

كيف تتفاعل أليلات CFTR داخل الفرد المصاب بالتليف الكيسي عند وجود طفرات من فئات مختلفة؟

كيف تتفاعل أليلات CFTR داخل الفرد المصاب بالتليف الكيسي عند وجود طفرات من فئات مختلفة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لذلك يتم تصنيف الطفرات في التليف الكيسي حسب شدة التأثير على إنتاج CFTR.

ولكن قد يكون للفرد طفرتان مختلفتان في CFTR.

أفترض أن الطفرة الأقل حدة بين الاثنين هي الأكثر صلة بالنمط الظاهري. على سبيل المثال ، من الأفضل أن يكون لديك طفرة من الصنف الأول والثاني تحتوي على طفرة من الفئة الأولى.

ومع ذلك ، لا يمكنني العثور على أي مراجع لدعم هذا أو شرح التفاعل الجزيئي بين الفئات. بالإضافة إلى ذلك ، أخشى أن يكون الأمر أكثر تعقيدًا من هذا.

الغرض من معرفة ذلك هو أنني أرغب في التحكم في فئة CFTR في تحليل الانحدار ، لكنني أقوم بإزالة الأفراد على ivacaftor أو ما شابه ، لذلك أنا أتحدث عن التأثير فقط على المستوى البيولوجي الأساسي بدلاً من الوصول التفاضلي إلى العلاجات الفعالة.


7 أغسطس 2014: تصحيح طاقم PLOS ONE (2014): CFTR طيف الطفرات وفعالية التشخيص الجزيئي في مرضى التليف الكيسي البولندي. بلوس واحد 9 (8): e105738. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105738 عرض التصحيح

يحدث التليف الكيسي (CF) بسبب طفرات في جين منظم غشاء التليف الكيسي (CFTR). في ضوء عدم التجانس الأليلي القوي والخصوصية الإقليمية لطيف الطفرات ، تتطلب استراتيجية التشخيص الجزيئي وتقديم المشورة في التليف الكيسي اختبارات وراثية لتعكس خصائص الترددات المميزة لمجموعة سكانية معينة. كان الهدف من الدراسة هو توفير تقدير شامل محدث لتوزيع CFTR الطفرات في مرضى التليف الكيسي البولندي ولتقييم فعالية INNOLiPA_CFTR الاختبارات في السكان البولنديين. تألفت المجموعة التي تم تحليلها من 738 مريضًا بتشخيص التليف الكيسي المؤكد سريريًا ، وتم فحصهم مسبقًا بحثًا عن عيوب جزيئية باستخدام INNOLiPA_CFTR لوحات من Innogenetics. كفاءة مشتركة لـ INNOLiPA CFTR_19 و CFTR_17_Tn تحديث كانت الاختبارات 75.5٪ تم اكتشاف كلا الطفرات في 68.2٪ ، وطفرة واحدة في 14.8٪ من الأفراد المصابين. تم تحليل المجموعة المكونة من جميع المرضى الذين تم اكتشاف طفرة واحدة فقط أو لم يتم الكشف عن أي طفرة (109 و 126 فردًا ، على التوالي) باستخدام نهج فحص الطفرات ، مثل تحليل SSCP / HD (تعدد الأشكال المطابق للخيط الفردي / مضاعف متغاير) لمنتجات PCR متبوعًا تسلسل تسلسل الترميز. نتيجة لذلك ، تم العثور على 53 طفرة أخرى في 97 مريضًا. كانت الكفاءة الإجمالية لاكتشاف أليل CF 82.5٪ (زيادة 7.0٪ مقارنة باختبارات INNOLiPA وحدها). تم تقييم توزيع الطفرات الأكثر تكرارا في بولندا. تم وصف معظم الطفرات التي تم العثور عليها بشكل متكرر في المرضى البولنديين سابقًا في مجموعات سكانية أوروبية أخرى. يمثل الأليل المتحور الأكثر شيوعًا ، F508del ، 54.5٪ من كروموسومات التليف الكيسي البولندي. ثمانية طفرات أخرى لها ترددات أكثر من 1٪ ، 24 لها ترددات بين 1 و 0.1٪ c.2052-2053insA و c.3468 + 2_3468 + 3insT كانت الطفرات الأكثر شيوعًا غير INNOLiPA. توزيع الطفرات الموصوفة هنا يتعلق أيضًا بالشتات البولندي. توضح دراستنا أيضًا أن الكفاءة المبلغ عنها للكشف عن الطفرات تعتمد بشدة على الخبرة التشخيصية للمراكز الصحية المحولة.

الاقتباس: Ziętkiewicz E ، Rutkiewicz E ، Pogorzelski A ، Klimek B ، Voelkel K ، Witt M (2014) CFTR طيف الطفرات وفعالية التشخيص الجزيئي في مرضى التليف الكيسي البولندي. بلوس واحد 9 (2): e89094. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089094

محرر: كلاوس بروسجارد ، مستشفى جامعة أودنسي ، الدنمارك

تم الاستلام: 14 سبتمبر 2013 وافقت: 15 يناير 2014 نشرت: 26 فبراير 2014

حقوق النشر: © 2014 Ziętkiewicz et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر.

التمويل: تم دعم هذا العمل من خلال المنحة المقدمة من اللجنة العلمية البولندية KBN-NN401-020-435 إلى EZ. لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.


العلاجات المستهدفة في طب الجهاز التنفسي - التليف الكيسي كنموذج

تطورت العلاجات المستهدفة في الطب بعد التقدم في التكنولوجيا الجزيئية والتخطيط الناجح للجينوم البشري. يتم التعرف على مثل هذه العلاجات جيدًا في علم الأورام ، حيث يتم استهداف الجزيئات اللازمة لنمو الورم وانتشاره بشكل خاص لإيقاف العملية الخبيثة أو منع تطور الورم [1 ، 2].

كانت هذه العلاجات مدفوعة بمفاهيم الدقة والطب الطبقي ، حيث يمكن استخدام المؤشرات الحيوية الجزيئية لاختيار أساليب محددة للأفراد أو مجموعات الأفراد ، على التوالي ، مما يتيح إنتاج علاجات فعالة للغاية ودقيقة [3]. تتضمن بعض مزايا العلاجات المستهدفة القدرة على تحديد المستجيبين للعلاج ، وتخصيص العلاج وفقًا للملف الجيني للفرد ، وتجنب الآثار الجانبية غير المرغوب فيها [4]. يتناقض هذا النهج بشكل مباشر مع معظم الأدوية المستخدمة حاليًا في الممارسة الطبية ، والتي تُستخدم لعلاج أعداد كبيرة من السكان بنفس تصنيف المرض الواسع ولكن مع عدم تجانس ملحوظ استجابة للعلاج.

إن التطورات الحديثة في دراسات الارتباط على مستوى الجينوم والفهم المتزايد للأساس الجيني للأمراض المعقدة قد مكنت من فحص مفهوم العلاجات المستهدفة في مجالات أخرى ، مثل طب الجهاز التنفسي. ومع ذلك ، هناك أمثلة قليلة على العلاجات المستهدفة في هذا المجال خارج مشاكل الأورام ، حيث أن معظم أمراض الرئة معقدة ومتعددة الجينات. لذلك ، يعد تطوير استراتيجيات للتشوهات الجزيئية المحددة في هذه الظروف أمرًا صعبًا. ومع ذلك ، فإن الاستثناء هو التليف الكيسي ، حيث يكون الخلل الجيني الأساسي محددًا جيدًا ويقع داخل CFTR الجين [5]. أصبح استخدام ivacaftor ، أحد محفزات وظيفة CFTR ، حقيقة ناجحة منذ عام 2012 كعلاج موجه لمرضى التليف الكيسي الناجم عن أنماط وراثية معينة ، ويمثل مثالًا قويًا للطب الدقيق [6]. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين المُحسِّن والمصحح (ivacaftor و lumacaftor) حصل على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عام 2015 لاستخدامه في الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي الناجم عن النوع الأكثر شيوعًا. CFTR طفرة ، Phe508del [7 ، 8].

في هذا الاستعراض نناقش الأساس السريري والجيني للتليف الكيسي ، وتطوير العلاجات التي تستهدف فئات معينة من CFTR لمعالجة العيوب الأساسية وتحسين وظيفة CFTR ، وظهور الطب الدقيق في التليف الكيسي كنموذج لأمراض الجهاز التنفسي الأخرى.


تطبيق نوكليازات تقييد HINDIII و EcoRI في تحديد وتشخيص التليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR -F508

يحدث التليف الكيسي (CF) بسبب طفرة في بروتين CFTR تمنع نقل الأملاح عبر أسطح الخلايا الظهارية مما يؤدي إلى فرط إنتاج المخاط والموت في النهاية. كان الغرض من هذه التجربة هو تحديد ما إذا كان المريض البالغ من العمر 3 سنوات مصابًا بالتليف الكيسي. ذكرت الفرضية أن جيف سيكون مصابًا بالتليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR ∆F508. كان من المتوقع أن يتم قطع الحمض النووي لجيف وعناصر التحكم الإيجابية / السلبية بواسطة EcoRI مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات بأحجام 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس وأن DNA جيف والتحكم الإيجابي سيتم قطعهما بواسطة HindIII بمجرد إنتاج اثنين أحزمة بأحجام 7،200 bp و 1،800 bp. استخدمت التجربة نوكليازًا داخليًا لتقييد EcoRI و HindIII في تحليل RFLP وتصور النتائج باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام agarose ، وتم حساب الحجم الجزيئي لشظايا الحمض النووي هذه من معادلة تم إنتاجها من رسم بياني منحنى قياسي. تم تضمين الحمض النووي لمريض مصاب بطفرة CFTR -F508 كعنصر تحكم إيجابي وتم تضمين الحمض النووي للمريض بدون طفرة CFTR -F508 كعنصر تحكم سلبي. أظهرت نتائج التجربة أن جميع عينات الحمض النووي المقطوعة بواسطة EcoRI أنتجت شظايا الحمض النووي ذات الحجم المماثل ، وتم قطع الحمض النووي لجيف والتحكم الإيجابي بشكل متماثل تقريبًا بواسطة HindIII ، بينما تم قطع التحكم السلبي بشكل مختلف. أدت هذه النتائج إلى قبول الفرضية ، مما يعني أنه تم تشخيص جيف بالتليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR -F508.

مقدمة

في الأفراد الأصحاء ، يستجيب الجسم لأمراض الجهاز التنفسي عن طريق زيادة مستويات المخاط في الرئتين والجهاز التنفسي. ومع ذلك ، يمكن لهذا المخاط أيضًا أن يحبس البكتيريا والمواد الغريبة ، لذلك ينقل بروتين منظم توصيل الغشاء التليف الكيسي (CFTR) الأملاح بما في ذلك أيونات الكلور وأيونات البيكربونات والأنيونات عبر خلايا الرئة الظهارية لترطيب الرئتين وإزالة المخاط الزائد (Gentzsch، 2018 جنوب وآخرون 2018).

ومع ذلك ، هناك أكثر من 2000 طفرة في جين CFTR يمكن أن تؤدي إلى مرض التليف الكيسي المميت (Southern et al. 2018). يتم تجميع طفرات CFTR هذه في خمس فئات مختلفة بناءً على كيفية تأثيرها على بروتين CFTR: تنتج طفرات الفئة الأولى بروتين CFTR غير فعال عن طريق إضافة كودون التوقف المبكر إلى التسلسل الجيني ، وتنتج طفرات الفئة الثانية بروتين CFTR غير طبيعي يتحلل معظمه بواسطة الخلية قبل أن تصل إلى بطانة الرئة ، تنتج طفرات الفئة الثالثة بروتينات CFTR التي لا يمكنها نقل الأيونات عبر خلايا الرئة الظهارية ، وتنتج طفرات الفئة الرابعة بروتينات CFTR المعطلة التي تواجه صعوبة في نقل الأيونات عبر خلايا الرئة الظهارية ، وتنتج طفرات الفئة الخامسة وظيفية بروتين CFTR ولكن بأعداد أقل من المعتاد لذلك يقلل هذا من كفاءته (Southern et al. 2018).

أكثر طفرات CFTR شيوعًا ، المسؤولة عن 90 ٪ من حالات التليف الكيسي (Cooney ، 2018) هو عيب من الفئة الثانية يسمى طفرة ∆F508 ، وتحدث هذه الطفرة المحددة عندما يتم حذف فينيل ألانين في الموضع 508 من جين CFTR (Suaud et آل 2011). هذا مرض وراثي جسمي متنحي شائع جدًا وقاتل يصيب واحدًا من كل 2000 من الأمريكيين الشماليين أو 70000 فرد على مستوى العالم (كتنج ، 2015 Southern et al. 2018). هذا المرض قاتل بسبب اختلال بروتين CFTR مما يعني أن المخاط يتراكم في الرئتين وقنوات البنكرياس التي تحبس البكتيريا ، وتضعف جهاز المناعة ، وتضر بالأعضاء ، وتسبب الالتهابات ، وغالبًا ما تؤدي إلى مرض السكري و / أو سوء التغذية ، عادة ، المرضى يموت من فشل الجهاز التنفسي (كتنج ، 2015 Southern et al. 2018). لحسن الحظ ، هناك العديد من العلاجات للتخفيف من آثار هذا المرض وإطالة عمر الأفراد المصابين ، وبما أن التليف الكيسي لا ينتج إلا عن طفرات في جين CFTR ، فمن السهل نسبيًا اختبار المرضى وتشخيصهم (كتنج ، 2015).

هذه الاضطرابات الجسدية المتنحية أحادية الجين (قطع ، 2015) تخلق نوعًا من التباين الجيني لجين CFTR داخل مجموعة سكانية تسمى تعدد الأشكال (Pare ، 2012). إحدى الطرق الأكثر شيوعًا لتشخيص تعدد الأشكال أحادية الطفرة هي باستخدام تقنية تسمى تحليل تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP) ، والتي تستخدم نوكليازات تقييدية لتقطيع تسلسلات الحمض النووي إلى أجزاء في مواقع محددة لمساعدة الباحثين في تحديد الاختلافات الجينية (Loenen et al. 2014 سابينزا ، 2012). نوكليازات التقييد هي إنزيمات يتم إنتاجها بشكل طبيعي في عدة أنواع من بدائيات النوى ولكن لها العديد من التطبيقات في التجارب الجينية المعملية (Pingoud وآخرون ، 2014). يتم تجميع نوكليازات التقييد أو REases في أربع فئات (النوع الأول ، والنوع الثاني ، والنوع الثالث ، والنوع الرابع) الأكثر استخدامًا في الاختبارات الجينية هي النوع الثاني REases التي تعمل عن طريق شق نطاقات الفوسفات على أو بالقرب من تسلسل التعرف في الحمض النووي ، تنتج هذه العملية أجزاء متسقة من الحمض النووي (Pingoud et al. 2014 Sapienza ، 2012).

اثنين من أكثر REases المفهومة من النوع الثاني تشمل EcoRI و HindIII: EcoRI الذي تم اكتشافه من Escherichia coli وتم اكتشاف HindIII من المستدمية النزلية (بينجود وآخرون 2014). على وجه التحديد ، يقوم EcoRI و HindIII بتحديد تسلسل التعرف على النوكليوتيدات المتداخلة الخاصة بهما ويقطع روابط الفوسفات بين النيوكليوتيدات: يتعرف EcoRI على GAATTC ويشق رابطة الفوسفات بين G و A ، بالإضافة إلى أنه سيتعرف ويقطع أي متواليات تختلف بقاعدة واحدة- الزوج ، HindIII يتعرف على AAGCTT ويشق رابطة الفوسفات بين الاثنين A (Loenen et al. 2014 Sapienza ، 2012). بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن هذين REases ينتجان قطع متداخلة متناظرة ، يمكن لشظايا الحمض النووي أن تصلب إلى حبلاها التكميلي وقد تم استغلال ذلك لتطبيقات الاستنساخ الجيني (Loenen et al. 2014). عندما يتم إضافة EcoRI إلى عينة الحمض النووي للدم أو اللعاب لمريض إما مع أو بدون طفرة CF∆F508 ، فإن EcoRI يشق جين CFTR مرتين لإنتاج ثلاث شظايا تبلغ 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس. ومع ذلك ، ينتج HindIII نتائج مختلفة عند إضافته إلى عينة الدم أو الحمض النووي للمرضى الذين يعانون من طفرة CF∆F508 وبدونها. في المرضى الذين لا يعانون من طفرة CF∆F508 ، يشق HindIII جين CFTR مرتين لإنتاج ثلاث شظايا تبلغ 1500 نقطة أساس و 5700 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. من ناحية أخرى ، في المرضى الذين يعانون من طفرة CF∆F508 ، لا يحدد HindIII تسلسل التعرف عند 1500 نقطة أساس بسبب حذف فينيل ألانين في الموضع 508 يعبث ببقية التسلسل ، لذلك بدلاً من ذلك ، يشق HindIII جين CFTR فقط لإنتاج جزأين تبلغ قيمتهما 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. السبب في أن HindIII ينتج نتائج مختلفة في المرضى الذين يعانون من الطفرة وبدونها ، بينما ينتج EcoRI نتائج متطابقة هو أن HindIII أكثر تحديدًا ويمكنه فقط تحديد تسلسل التعرف الدقيق بينما EcoRI أقل تحديدًا قليلاً ويمكنه تحديد تسلسلات متنوعة قليلاً. يمكن تحليل نتائج تحليل RFLP بالرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز ، وتضاف صبغة الفلورسنت إلى عينات الحمض النووي بحيث تتألق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن المسافة التي قطعتها الأجزاء. المسافة التي تقطعها العينات تتناسب مع طولها ، وبالتالي ، يمكن استخدام المسافات التي تقطعها شظايا الحمض النووي لإنشاء معادلة من منحنى قياسي يستخدم المسافات التي قطعتها عينات الحمض النووي الأخرى لتحديد حجمها الجزيئي.

ستختبر هذه التجربة طفلًا يبلغ من العمر 3 سنوات يُدعى جيف بسبب التليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR ∆F508. لتحديد ما إذا كان جيف مصابًا بالتليف الكيسي ، سيخضع الحمض النووي الخاص به لتحليل RFLP مع نوكلياز التقييد EcoRI و HindIII. سيخضع التحكم الإيجابي (المريض المصاب بطفرة ∆F508) والتحكم السلبي (المريض بدون طفرة ∆F508) أيضًا لتحليل RFLP باستخدام EcoRI و HindIII بحيث يمكن مقارنة نتائج Jeff بشيء ما. سيتم تصور نتائج تحليل RFLP بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز ثم سيتم استخدام المعادلة الناتجة من منحنى قياسي لحساب الأحجام الجزيئية لشظايا الحمض النووي بعد قطعها بواسطة REases. من المهم تحديد ما إذا كان جيف مصابًا بالتليف الكيسي ونوع الطفرة التي يسببها التليف الكيسي حتى يتمكن من تلقي أفضل علاج حتى يتمكن من العيش حياة طويلة خالية من الألم.

يُفترض أن جيف يعاني من التليف الكيسي لأنه يظهر عليه العديد من الأعراض المصاحبة للتليف الكيسي بما في ذلك الصفير ، والطقطقة ، والسعال المستمر ، والبراز الدهني ، وسيلان الأنف. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن التليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR -F508 هو اضطراب وراثي جسمي متنحي ، فمن المحتمل أن كلا والديه كانا حاملين للطفرة وأنه ورث أليلين متحولين ، وهذا يفسر سبب عدم وجود تاريخ طبي لوالديه للإصابة بالكيسي. تليف.

إذا كانت هذه الفرضية صحيحة وكان لدى Jeff بالفعل تليف كيسي ناتج عن طفرة CFTR -F508 ، فمن المتوقع أنه عندما يتم قطع الحمض النووي الخاص به بواسطة EcoRI مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات لها أوزان جزيئية تبلغ 2150 نقطة أساس ، و 2150 نقطة أساس ، و 4،700 نقطة أساس وأنه سيتم قطع الحمض النووي الخاص به بواسطة Hind III مرة واحدة لإنتاج نطاقيْن لهما أوزان جزيئية تبلغ 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. أيضًا ، سيتم أيضًا قطع عناصر التحكم (المرضى الذين يعانون من طفرة ∆F508 أو بدونها) بواسطة EcoRI مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات لها أوزان جزيئية تبلغ 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس. لذلك ، فإن الحمض النووي لجيف والمرضى الذين يعانون من طفرة ∆F508 وبدونها سيكون لديهم نطاقات ذات أوزان جزيئية متطابقة عند قطعها بواسطة EcoRI. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضًا قطع التحكم الإيجابي (المريض المصاب بطفرة ∆F508) بواسطة HindIII مرة واحدة لإنتاج نطاقيْن لهما أوزان جزيئية تبلغ 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. في حين أن التحكم السلبي (المريض بدون طفرة ∆F508) سيتم قطعه مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات لها أوزان جزيئية تبلغ 5700 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس و 1500 نقطة أساس. هذا يعني أن النطاقات التي تظهر عند قطع عينة DNA الخاصة بـ Jeff باستخدام Hind III يجب أن تكون متطابقة في الوزن مع المريض المصاب بطفرة ∆F508 التي تم قطع الحمض النووي أيضًا باستخدام HindIII ، ويجب أن تكون كلتا العينات مختلفة عما كانت عليه عند استخدام HindIII مع المريض الذي ليس لديه طفرة ∆F508.

المواد

للبدء ، تم الحصول على ست عينات من الحمض النووي: عينتان من المريض الذي يتم اختباره بحثًا عن التليف الكيسي (جيف) ، وعينتين من فرد مصاب بطفرة ∆F508 ، وعينتين من فرد بدون طفرة ∆F508. تم قطع العينات من الفرد المصاب بطفرة ∆F508 مسبقًا باستخدام EcoRI و HindIII على التوالي ، ولم تتم إضافة أي شيء آخر إلى هذه العينات حتى تمت إضافة صبغة التحميل. تم دمج المخزن المؤقت للتفاعل مع العينات الأخرى ، ثم تمت إضافة EcoRI إلى عينة DNA واحدة للفرد بدون طفرة ∆F508 وإلى واحدة من عينة DNA الخاصة بـ Jeff. بعد ذلك ، تمت إضافة HindIII إلى عينة DNA واحدة للفرد بدون طفرة ∆F508 وإلى واحدة من عينة DNA الخاصة بـ Jeff. تم تحضين هذه العينات الأربع عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة. تم تحضير محلول من جل الاغاروز بنسبة 0.8 ٪ باستخدام محلول agarose و 1x TAE و 10000x Sybr Safe DNA gel stain. يُسكب هذا المحلول في صينية هلامية مقفلة في رف صب ، ويضاف مشط ثم يوضع الجل في الثلاجة لمدة ثلاثين دقيقة حتى يتصلب. تمت إزالة المشط ثم تم إنزال صينية الهلام بالجيل الصلب في حجرة الرحلان الكهربائي وغمرها في محلول TAE 1x. تمت إضافة صبغة تحميل تحتوي على Ficol إلى كل عينة من عينات الحمض النووي الست. تم تحميل علامة في أول بئر / ممر لعرض نطاقات من الأحجام الجزيئية التالية: 12000 نقطة أساس و 7000 نقطة أساس و 3000 نقطة أساس و 2500 نقطة أساس و 2000 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس و 1500 نقطة أساس.ثم تم تحميل عينات الحمض النووي الست التي تم قطعها باستخدام EcoRI أو HindIII في آبار منفصلة. تم وضع الغطاء على حجرة الرحلان الكهربي بحيث تمتد الشحنة من الطرف السالب إلى الطرف الموجب ، وسمح للجهاز بالعمل لمدة 45 دقيقة عند 120 فولت حتى انقضاء منتصف الطريق خلال الهلام. تمت إزالة الجل من الجهاز ومشاهدته على أداة نقل الأشعة فوق البنفسجية بجوار المسطرة بحيث يمكن قياس المسافة التي قطعتها كل صبغة. تم إنشاء رسم منحنى قياسي بالبيانات من قياسات العلامة. تم استخدام المعادلة التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الرسم البياني لتقريب الحجم الجزيئي للعصابات من عينات الحمض النووي الست. (DeCicco-Skinner ، 2019).

نتائج

الشكل 1: عرض الجل على قمة ترانسلومينيتور الأشعة فوق البنفسجية بجوار مسطرة متري. احتوى المسار 1 على العلامة وأنتج 7 نطاقات مرئية ، الممر 2 يحتوي على E (الحمض النووي للمريض بدون طفرة ∆F508 ، مقطوع باستخدام EcoRI) ، الممر 3 يحتوي على + E (الحمض النووي للمريض مع طفرة ∆F508 ، مقطوع باستخدام EcoRI) ، الممر 4 يحتوي على JE (قطع DNA Jeff باستخدام EcoRI) ، الممر 5 يحتوي على H (الحمض النووي للمريض بدون طفرة ∆F508 ، مقطوعًا بـ HindIII) ، الممر 6 يحتوي على + H (DNA للمريض مع ∆F508 طفرة ، مقطوعة باستخدام HindIII) ، الممر 7 يحتوي على JH (قطع DNA Jeff مع HindIII). أنتجت كل من الممرات 2 و 3 و 4 حزمتين متطابقتين تقريبًا عبر الآبار الثلاثة. أنتج لين 5 أربع نطاقات. أنتج الممران 6 و 7 شريطين متطابقين تقريبًا.

تم قياس المسافة التي قطعتها العصابات على الجل من المسافة بين البئر وقاع الشريط. احتوت العلامة من الممر 1 على نطاقات من عدة أوزان جزيئية: سافر النطاق 12000 نقطة أساس سافر 21.5 ملم ، وانتقل نطاق 7000 نقطة أساس 26.5 ملم ، وانتقل نطاق 3000 نقطة أساس عند 29.2 ملم ، وانتقل نطاق 2500 نقطة أساس 34.4 ملم ، وانتقل نطاق 2000 نقطة أساس 37.9 ملم ملم ، تحرك النطاق 1800 نقطة أساس 40.5 ملم ، وانتقل نطاق 1500 نقطة أساس 44.1 ملم (الشكل 1). تم تحميل المسار 2 بالحمض النووي للمريض بدون طفرة ∆F508 التي تم قطعها باستخدام EcoRI ، وعرض الممر 2 شريطين: أحدهما سافر 28.1 مم والآخر سافر 35.2 مم (الشكل 1). تم تحميل المسار 3 بالحمض النووي للمريض بطفرة ∆F508 التي تم قطعها باستخدام EcoRI ، وكان للمسار 3 شريطين أيضًا: أحدهما سافر 27.8 ملم والآخر 36.1 ملم (الشكل 1). تم تحميل المسار 4 بحمض نووي جيف وتم قطعه باستخدام EcoRI ، كما كان للمسار 4 شريطين في نفس الموقع تقريبًا مثل البئرين السابقتين: شريط سافر 28.0 مم والآخر سافر 35.9 مم (الشكل 1). تم تحميل المسار 5 بالحمض النووي للمريض بدون طفرة ∆F508 التي تم قطعها باستخدام HindIII ، وكان للمسار 5 أربعة نطاقات تتحرك 27.8 مم و 35.8 مم و 42.3 مم و 44.1 مم (الشكل 1). تم تحميل المسار 6 بالحمض النووي للمريض بطفرة ∆F508 التي تم قطعها باستخدام HindIII ، وكان للمسار 6 شريطين يسافران 26.1 مم و 43.5 مم (الشكل 1). تم تحميل المسار 7 بحمض نووي جيف وتم قطعه باستخدام HindIII ، وكان للمسار 7 شريطين متشابهين جدًا مع الممر 6 ، ويتنقلان 26.0 مم و 43.5 مم (الشكل 1).

الشكل 2: عرض المنحنى القياسي لهضم تقييد طفرة CFTR F508. تم رسم سجل الوزن الجزيئي لكل نطاق محدد على المحور الصادي ، والمسافة بالمليمترات التي هاجر إليها كل نطاق من البئر التي تم تحميل العلامة فيها تم رسمها على المحور السيني. من هذه البيانات تم إضافة خط اتجاه خطي ، وتم حساب وعرض معادلة الخط الأفضل ملاءمة (y = -0.0391x + 4.8133) ، وتم حساب معامل التحديد وعرضه (R ^ 2 = 0.8987).

تم استخدام القياسات التي تم جمعها من الشكل 1 لإنشاء الرسم البياني للمنحنى القياسي في الشكل 2. أدت إضافة خط اتجاه خطي إلى إنتاج معادلة للخط الأفضل ملاءمة (y = -0.0391x + 4.8133) وأسفرت عن معامل تحديد 0.8987 . تم توصيل المسافة التي قطعها كل نطاق للعينات الست في هذه المعادلة ثم تم أخذ antilog لحساب حجم النطاق التقريبي.

الجدول 1: هضم تقييد طفرة CFTR ∆F508 بواسطة نتائج EcoRI و HindIII لـ Jeff ، المريض المصاب بطفرة CFTR -F508 ، والمريض بدون طفرة CFTR -F508.
الجدول 1: عرض الوزن الجزيئي المتوقع مقابل المرصود للعلامة وستة عينات من الحمض النووي مقطوعة باستخدام EcoRI أو HindIII. تم حساب الوزن الجزيئي لكل عينة من معادلة المنحنى القياسية (y = -0.0391x + 4.8133). تحتوي الممرات 2 و 3 و 4 على نطاقات ذات أحجام متشابهة جدًا وكانت القيم قريبة مما كان متوقعًا. يحتوي المسار 5 على نطاقات أكثر مما كان متوقعًا. كان للمسارين 6 و 7 نطاقات متشابهة جدًا وقريبة مما كان متوقعًا.

من المعادلة في الشكل 2 ، تم حساب أحجام النطاق المرصودة لعينات DNA الست وتم تسجيلها في الجدول 1. كما تم حساب أحجام النطاق الملحوظة للعلامة بحيث يمكن تحديد مقدار الخطأ كميًا. يوضح الجدول 1 أن الوزن الجزيئي المحسوب يختلف عن الوزن الجزيئي المتوقع ، ويكون هذا الاختلاف أكثر وضوحًا عندما يحتوي النطاق على أزواج أساسية أكثر. هذا يعني أن حجم النطاق الملحوظ لعينات الحمض النووي يجب ألا يتطابق تمامًا مع حجم النطاق المتوقع وأن القيمة ستكون أكثر دقة للنطاقات التي تحتوي على أزواج قاعدة أقل. بالنسبة لعينات الحمض النووي الثلاث المقطوعة باستخدام EcoRI (المرضى الذين لديهم (+ E) وبدون (-E) طفرة CFTR -F508 ، و Jeff (JE)) كان من المتوقع أن يقوم EcoRI بقطع شريط الحمض النووي مرتين لإنتاج ثلاث نطاقات: نطاقيان كانا 2150 نقطة أساس ونطاق واحد كان 4700 نقطة أساس. ومع ذلك ، كشفت مراقبة هذه العينات عن شريطين فقط. قام Patient -E بحساب نطاقات تبلغ 2500 نقطة أساس و 5183 نقطة أساس للمريض + E وقد حسبت نطاقات قدرها 2522 نقطة أساس و 5325 نقطة أساس للمريض JE وقد حسبت نطاقات قدرها 2568 نقطة أساس و 5229 نقطة أساس. هذه القيم قريبة جدًا ومتطابقة بشكل أساسي. كان من المتوقع أن يتم قطع المريض الذي لا يمتلك طفرة CFTR -F508 (-H) الذي تم قطع الحمض النووي الخاص به باستخدام HindIII مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات: 1500 نقطة أساس ، و 5700 نقطة أساس ، و 1800 نقطة أساس. ومع ذلك ، لوحظت أربعة نطاقات تشير إلى قطع الحمض النووي في أربعة أماكن. أنتج هذا نطاقات تم حسابها على أنها 1،227 نقطة أساس و 1،443 نقطة أساس و 2،591 نقطة أساس و 5،325 نقطة أساس. كان من المتوقع قطع المريض المصاب بطفرة CFTR ΔF508 (+ H) وجيف (JH) الذي تم قطع الحمض النووي الخاص به باستخدام HindIII مرة واحدة لإنتاج شريطين يبلغان 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. في الواقع ، تم قطع هاتين العينتين مرة واحدة ، في مريض + H كانت أحجام النطاق 6206 نقطة أساس و 1،296 نقطة أساس ، بينما في مريض JH كانت أحجام النطاق 6262 نقطة أساس و 1،296 نقطة أساس. هذه القيم متشابهة جدًا بحيث يمكن اعتبار أحجام النطاق متطابقة.

مناقشة

مع وجود أكثر من 2000 تعدد الأشكال لطفرات التليف الكيسي ، هناك بالتأكيد الكثير مما يمكن أن يحدث بشكل خاطئ بالنسبة لجين CFTR. في مثال طفرة CFTR -F508 ، يتم حذف حمض أميني واحد (فينيل ألانين) في الموضع 508 من الجين (Suaud et al. 2011). يعد حذف الفينيل ألانين في هذا الموضع شديدًا لدرجة أن بروتين CFTR يصبح غير فعال ، مما يؤدي إلى فرط إنتاج المخاط عبر الأسطح الظهارية (Kreda et al. 2012). تم التعرف على بروتين CFTR من خلال العديد من التجارب على أنه قناة أنيون نشطة تعتمد على الفسفرة (cAMP) والتي تنقل الأملاح (أيونات الكلوريد وأيونات البيكربونات) والأنيونات الأخرى عبر الخلايا الظهارية (Gentzsch ، 2018). تنقل بروتينات CFTR الصحية التي تعمل بكامل طاقتها هذه الأملاح عبر غشاء البلازما للخلايا الظهارية التي تبطن الرئتين والأعضاء الأخرى لإزالة المخاط الزائد عن طريق ترطيب السطح (Gentzch، 2018 Suaud et al. 2011). في حالة طفرة CFTR ∆F508 ، يتم إنتاج بروتين CFTR غير طبيعي لا يمكن أن ينثني بشكل صحيح لأن قسم CFTR الذي يتفاعل مع ATP لربط النيوكليوتيدات يسمى مجال ربط النوكليوتيدات (NBDI) والحلقة الرابعة الخلوية ضمن قسم آخر من CFTR الذي يثبت بروتينًا آخر في غشاء البلازما (MSD 2) يشكل روابط هيدروجينية مع حمض الأرجينين الأميني في كودون 1070 (كتنج ، 2015). تكتشف الخلية بروتينات CFTR المشوهة وتحلل معظمها داخل الشبكة الإندوبلازمية (Suaud et al. 2011). هذا يعني أن القليل جدًا من بروتين CFTR يصل إلى سطح الخلايا الظهارية أو لا يصل إليه أي شيء ، وبالتالي لا يمكن نقل أيونات الكلوريد والبيكربونات عبر غشاء البلازما (Suaud et al. 2011). نظرًا لأنه لا يمكن نقل أيونات الملح عبر غشاء البلازما ، فإن الأملاح تكون بتركيز أعلى على الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية ، وهذا يسحب الماء بعيدًا عن السطح القمي ويؤدي إلى جفاف الرئة والجهاز الهضمي والبنكرياس (Gentzsch) ، 2018). في حالة عدم وجود ماء على الأسطح القمية لهذه الأعضاء ، لا يمكن إزالة المخاط الزائد ، ثم يؤدي المخاط الكثيف اللزج إلى حدوث انسداد ويؤدي إلى أمراض الجهاز التنفسي والتهابات تؤدي في النهاية إلى الوفاة لدى المرضى (Gentzsch، 2018).

اختبرت هذه التجربة جيف البالغ من العمر 3 سنوات من أجل التليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR ∆F508 باستخدام تحليل RFLP مع نوكليازات تقييدية EcoRI و HindIII. تمت مقارنة نتائجه مع عنصر تحكم إيجابي (مريض مصاب بطفرة ∆F508) وضبط سلبي (مريض بدون طفرة ∆F508) تم تضمينهما أيضًا في تحليل RFLP باستخدام EcoRI و HindIII بحيث يمكن مقارنة نتائج Jeff بشيء ما. تم تصور نتائج تحليل RFLP باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز (الشكل 1) ثم تم إنتاج معادلة من منحنى قياسي (الشكل 2) والذي تم استخدامه لحساب الأحجام الجزيئية (الجدول 1) لشظايا الحمض النووي التي قيد التقييد أنتجت نوكليازات داخلية. يعد هذا التشخيص المبكر أمرًا بالغ الأهمية لضمان حصول جيف على الرعاية التي يحتاجها حتى يتمكن من العيش حياة طويلة وخالية من الألم. علاوة على ذلك ، يعد تحليل RFLP طريقة أكثر موثوقية لاختبار الاضطرابات الصبغية المتنحية مقارنة بالاختبارات الجينية المباشرة للمستهلكين مثل 23andMe TM نظرًا لوجود مساحة أقل لسوء الفهم. تقيس شركات مثل 23andMe TM التباين الجيني من خلال مقارنة المعلومات الجينية للعميل بقاعدة بيانات الطفرات الخاصة بهم ، ويمكن لقاعدة البيانات هذه اكتشاف 715000 طفرة نكليوتيدية واحدة (Lu et al. 2017). هذا يعني أن قاعدة البيانات ستكتشف حذف ثلاثي النوكليوتيدات الذي يحدث عند حذف فينيل ألانين في الموضع 508 من جين CFTR. يختلف RFLP عن هذا لأنه لا يقارن التسلسل الجيني ، بل يستخدم نوكليازات مقيدة لتقطيع الحمض النووي إلى أجزاء في تسلسل التعرف ، في هذه الحالة ، يمكن تشخيص التليف الكيسي إذا تم قطع الحمض النووي للمريض في نفس المواقع مثل مراقبة إيجابية. تتمثل إحدى ميزات الاختبارات الجينية مثل تلك التي يوفرها 23andMeTM في أنه يمكنهم أيضًا معرفة ما إذا كان المريض حاملًا لطفرة متنحية ، وهذا شيء لا يمكن لتحليل RFLP القيام به (Lu et al. 2017). ومع ذلك ، فإن أحد أكبر المخاوف بشأن الاختبار الجيني المباشر للمستهلك هو أن معظم الناس لا يعرفون كيفية تفسير النتائج وقد يتخذون سلوكيات جذرية نتيجة عدم تلقي الاستشارة الوراثية (Pare ، 2012) ، وهذا سبب آخر لماذا من المهم اختبار التليف الكيسي باستخدام RFLP بدلاً من استخدام 23andMeTM.

تم الافتراض بأن جيف مصاب بالتليف الكيسي الناجم عن طفرة CFTR -F508 لأنه يظهر العديد من الأعراض المرتبطة بالمرض. سيكون هذا ممكنًا إذا كان كلا والديه حاملين لطفرة CFTR -F508 لأن الناقلين ليس لديهم أعراض لأن المرض يحدث فقط عندما يتم تحور كلا الأليلين في هذا الموقع من جين CFTR. كان من المتوقع أنه عندما يتم قطع الحمض النووي لجيف بواسطة EcoRI مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات بأحجام 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس وأن الحمض النووي الخاص به سيتم قطعه بواسطة HindIII بمجرد إنتاج شريطين بأحجام 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. . أيضًا ، سيتم قطع عينات EcoRI (المرضى الذين يعانون من طفرة ∆F508 وبدونها) بواسطة EcoRI مرتين بطريقة مماثلة للحمض النووي الخاص بجيف الذي ينتج ثلاثة نطاقات بأحجام 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس. بمعنى أن الحمض النووي لجيف والحمض النووي للمرضى الذين يعانون من طفرة ∆F508 وبدونها يجب أن يكون لديهم نطاقات متطابقة في الحجم عند قطعها بواسطة EcoRI. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضًا قطع عنصر التحكم الإيجابي (المريض المصاب بطفرة ∆F508) بواسطة HindIII مرة واحدة ، على غرار DNA Jeff الذي ينتج شريطين بأحجام 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. هذا على عكس التحكم السلبي (المريض بدون طفرة ∆F508) الذي تم توقع قطع الحمض النووي الخاص به مرتين ، مما ينتج ثلاثة نطاقات بأحجام 5700 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس و 1500 نقطة أساس. إذا كانت الفرضية صحيحة ، فإن النطاقات التي تظهر عند قطع عينة DNA الخاصة بـ Jeff باستخدام HindIII ستكون متطابقة في الوزن مع المريض المصاب بطفرة ∆F508 الذي تم قطع الحمض النووي أيضًا باستخدام HindIII ، ويجب أن تكون كلتا العينات مختلفة عما كانت عليه عند HindIII تم استخدامه مع المريض الذي ليس لديه طفرة ∆F508.

كان الغرض من تضمين عنصر التحكم الإيجابي هو أنه يمكن تصور نتائج هضم التقييد الهندسي للفرد المصاب بطفرة ∆F508 ثم مقارنتها بكيفية قطع الحمض النووي لجيف ، إذا تم قطعها بنفس الطريقة ، فهذا يعني أنه أيضًا لديه نفس الشيء تعدد الأشكال CFTR. إذا تم قطع الحمض النووي الخاص به بشكل مختلف عن عنصر التحكم الإيجابي ، فهذا يعني أنه ليس لديه طفرة ∆F508. كان الغرض من تضمين عنصر التحكم السلبي هو أنه يمكن تصور نتائج هضم التقييد الهندسي للفرد بدون طفرة ∆F508 ثم مقارنتها بكيفية قطع الحمض النووي لجيف. إذا تم قطع التحكم السلبي بشكل مختلف عن كل من عنصر التحكم الإيجابي و DNA Jeff ، فهذا يعني أنه لا يمتلك طفرة ∆F508. ومع ذلك ، إذا لم تتطابق نتائج Jeff مع النتائج الإيجابية أو السلبية ، فهذا يعني أن نتائج التجربة غير صالحة. أيضًا ، إذا كانت الضوابط الإيجابية والسلبية متطابقة عند القطع بواسطة HindIII ، فستكون النتائج التجريبية غير صالحة. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن نتائج تحليل RFLP ستكون هي نفسها بالنسبة لجيف وعناصر التحكم عند القطع باستخدام EcoRI ، فقد تم تضمين EcoRI لأنه إذا لم ينتج عن ذلك نتائج متطابقة لجميع العينات ، فإن نتائج التجربة ستكون لها ليتم استدعاؤهم.

تم نقل العلامة التي تم تحميلها في الممر 1 بنجاح عبر الجل (الشكل 1) وأنتجت نطاقات عند 12000 نقطة أساس و 7000 نقطة أساس و 3000 نقطة أساس و 2500 نقطة أساس و 2000 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس و 1500 نقطة أساس كما كان متوقعًا (الجدول 1). تم قياس المسافة التي تم ترحيلها من كل نطاق وتم رسم هذه البيانات مقابل سجل كل وزن جزيئي لإنتاج منحنى قياسي أسفر عن معامل تحديد 0.8987 والخط الأنسب للمعادلة y = -0.0391x +4.8133 (الشكل 2) ). تم توصيل المسافة التي قطعها كل نطاق للعينات الست في هذه المعادلة ثم تم أخذ antilog لحساب حجم النطاق التقريبي. تم استخدام هذه المعادلة لحساب حجم العلامات أيضًا لتحديد مقدار الخطأ الرياضي الموجود في هذا النموذج. يوضح الجدول 1 أن الوزن الجزيئي المحسوب يختلف قليلاً عن الوزن الجزيئي الفعلي ، ويتم تضخيم هذا التأثير عندما يحتوي الحمض النووي على أزواج قاعدية أكثر. بمعنى أن نتائج عينات الحمض النووي الأخرى يمكن أن يكون لها أيضًا بعض الاختلاف في الوزن الجزيئي المتوقع مقابل الوزن الجزيئي المرصود للنطاقات ، وحتى مع مثل هذا الاختلاف ، ستظل النتائج صالحة. تم استخدام هذه المعادلة أيضًا لحساب الأحجام الجزيئية للعصابات الموضحة على الجل في الشكل 1. إذا كانت الفرضية صحيحة ، فسيتم قطع كل من DNA جيف والمريض المصاب بطفرة ∆F508 والمريض بدون طفرة ∆F508 مرتين بواسطة EcoRI لإنتاج نطاقات ذات أوزان جزيئية تبلغ 2150 نقطة أساس و 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس. نظرًا لأن اثنين من هذه النطاقات لها نفس الوزن الجزيئي ، فسيظهر شريطين فقط على الهلام: 2150 نقطة أساس و 4700 نقطة أساس. أظهرت مراقبة عينات الحمض النووي هذه أن لديهم جميعًا نطاقين (الشكل 1 - الممرات 2،3،4) وكشفت الحسابات من معادلة المنحنى القياسية أن الوزن الجزيئي لهذين النطاقين في العينات الثلاث كان متشابهًا جدًا: في JE تم حساب أحجام شظايا الحمض النووي على أنها 2568 نقطة أساس و 5229 نقطة أساس في - تم حساب أحجام النطاقات على أنها 2500 نقطة أساس و 5183 نقطة أساس في + E وتم حساب أحجام النطاقات على أنها 2522 نقطة أساس و 5325 نقطة أساس (الجدول 1). نظرًا لأن EcoRI قام بقطع جميع العينات في نفس المكان تقريبًا ، فيمكن استنتاج أن تحليل RFLP يعمل بشكل صحيح وأن النتائج الأخرى للتجربة يجب أن تعمل أيضًا بشكل صحيح. هذا يعني أيضًا أن جين CFTR كان موجودًا بالفعل في جميع عينات الحمض النووي لأنه إذا كانت أي من العينات تفتقر إلى جين CFTR ، فلن تكون العينات قد أنتجت أجزاء متطابقة من الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن هذه النتائج وحدها لا يمكن أن توفر تشخيصًا للتليف الكيسي لأن إنزيم EcoRI يقطع التحكم الإيجابي والسلبي بنفس الطريقة. إذا كان EcoRI والتحكم الإيجابي هما الأشياء الوحيدة المستخدمة لتشخيص Jeff ، لكان من الممكن قبول الفرضية لأن جين CFTR مقطوع إلى أجزاء الحمض النووي نفسها من أجل التحكم الإيجابي وجيف. من المفارقات ، إذا كان EcoRI والتحكم السلبي هما الأشياء الوحيدة المستخدمة لتشخيص Jeff ، فسيتم رفض الفرضية لأن جين CFTR مقطوع إلى نفس أجزاء الحمض النووي للتحكم السلبي وجيف. من الواضح أن هذا يمثل مشكلة لأن الفرضية لا يمكن قبولها ورفضها على حد سواء ، لذلك ، من أجل التشخيص الدقيق لجيف بالتليف الكيسي ، يجب استخدام نوكلياز مقيد يقطع التحكم الإيجابي والسلبي بشكل مختلف ، ولهذا السبب تم استخدام HindIII أيضًا.

إذا كانت الفرضية صحيحة ، فسيتم قطع الحمض النووي لجيف والمريض (الضبط الإيجابي) المصاب بطفرة ∆F508 مرة واحدة بواسطة HindIII لإنتاج نطاقات ذات أوزان جزيئية تبلغ 7200 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس. أظهرت مراقبة عينات الحمض النووي هذه أنهما تم قطعهما مرة واحدة ولديهما شريحتان (الشكل 1 - الممران 6 و 7) وكشفت الحسابات من معادلة المنحنى القياسية أن الوزن الجزيئي لهذين النطاقين في كلتا العينات كان متشابهًا: في JH تم حساب أحجام النطاقات على أنها 6،262 نقطة أساس و 1،296 نقطة أساس وفي + H تم حساب أحجام النطاقات على أنها 6،206 نقطة أساس و 1،296 نقطة أساس (الجدول 1). نظرًا لأن HindIII قطع كل من DNA Jeff والحمض النووي للمريض الذي لديه طفرة ∆F508 ، فمن المحتمل أن يكون لدى Jeff أيضًا طفرة ∆F508 التي تسبب التليف الكيسي. للتأكد من صحة هذه النتائج ، يجب مقارنة هاتين العينتين بالتحكم السلبي - المريض بدون طفرة CFTR ∆F508. كشفت المراقبة أن الحمض النووي للمريض (-H) بدون طفرة ∆F508 تم قطعه ثلاث مرات بواسطة Hind III لإنتاج أربعة نطاقات (الشكل 1) وتم حساب هذه النطاقات بحيث تحتوي على أوزان جزيئية تبلغ 1،227 نقطة أساس ، 1،443 نقطة أساس ، 2،591 نقطة أساس. و 5،325 نقطة أساس (الجدول 1). من الواضح أن هذه النتائج لا تتطابق مع التنبؤ الذي ذكر أن HindIII سيتم قطع الحمض النووي لهذا المريض مرتين لإنتاج ثلاثة نطاقات بأوزان جزيئية تبلغ 5700 نقطة أساس و 1800 نقطة أساس و 1500 نقطة أساس. ومع ذلك ، يبدو أن العصابات العلوية تتماشى مع العصابات من العينات المقطوعة باستخدام EcoRI. مما يعني أن هذه العينة كانت على الأرجح ملوثة ببعض مادة EcoRI.يتعارض هذا مع تحليل النتائج ، ومع ذلك ، لا يزال من الممكن استخلاص بعض الاستنتاجات بسبب وضع هذه النطاقات بالنسبة لعينات HindIII الأخرى. أولاً ، النتائج مختلفة بدرجة كافية بحيث يمكن استنتاج أن JH و + H متطابقان بينما -H كان مختلفًا. ثانيًا ، تحتوي العينة -H على نطاق أدنى من النطاق الأدنى في + H و JH (الشكل 1 - الممرات 5 ، 6 ، 7). سيكون هذا منطقيًا إذا كانت الفرضية صحيحة لأن -H يجب أن يكون أصغر نطاق لها هو 1500 نقطة أساس و + H / JH يجب أن يكون لها أصغر نطاقاتها عند 1800 BP (الجدول 1). ثالثًا ، الطريقة الوحيدة التي يمكن بها قطع عينة DNA الخاصة بجيف بواسطة HindIII عند 7200 نقطة أساس ستكون إذا كان لديه طفرة CFTR -F508 (الشكل 1 والجدول 1). لذلك ، تم قبول الفرضية ، حيث يعاني جيف من تليف كيسي ناتج عن طفرة CFTR ∆F508.

إذا تم حذف التحكم الإيجابي ، فسيكون التشخيص صعبًا للغاية ولا يمكن تأكيد الفرضية ، لأن الحجم الجزيئي المحسوب لشظايا DNA Jeff يختلف عن الأحجام الجزيئية المتوقعة. لاحظ أن الحجم الجزيئي المحسوب لـ يختلف أيضًا عن الحجم المتوقع لشظايا الحمض النووي للتحكم الإيجابي وأن الحجم الجزيئي لهذه الأجزاء و Jeff's كان متطابقًا تقريبًا عند القطع بواسطة HindIII كان العامل النهائي الذي أدى إلى قبول الفرضية. إذا تم حذف عنصر التحكم السلبي ، فستظل الفرضية مقبولة لأن DNA Jeff كان سيظل مطابقًا للتحكم الإيجابي. ومع ذلك ، في السيناريو البديل حيث لم يكن مصابًا بالتليف الكيسي ، فإن فقدان التحكم السلبي يعني أنه سيكون من المستحيل تأكيد أن جيف لم يكن مصابًا بالتليف الكيسي لأن أجزاء الحمض النووي الخاصة به لن تتطابق مع أي شيء عند قطعه بواسطة HindIII.

استخدمت هذه التجربة فقط جزء جينوم جيف الذي يتضمن جين CFTR. إذا استخدمنا الجينوم الكامل لمريض مصاب بالطفرة أو بدونها ، فإن EcoRI و HindIII سيكونان قد حددا العديد من مواقع التعرف (GAATTC و AAGCTT على التوالي) ومجموعات الفوسفات المشقوق في هذه المواقع ، وهذا من شأنه أن ينتج العديد من أجزاء الحمض النووي. في الواقع ، الكثير من شظايا الحمض النووي سيكون من الصعب معرفة ما كنت تبحث عنه ، بدلاً من رؤية بعض النطاقات في الشكل 1 بدلاً من ذلك ، قد يكون هناك مئات العصابات. هذا سيجعل من المستحيل تحديد ما إذا كان جيف لديه طفرة في CFTR أم لا. سيحتاج بروتوكول المختبر إلى التعديل إذا تم استخدام جينومات كاملة بحيث يمكن فحص منطقة معينة من الحمض النووي. إحدى الطرق لتحقيق ذلك هي من خلال النشاف الجنوبي: حيث يتم نقل شظايا الحمض النووي من الرحلان الكهربائي إلى غشاء عن طريق النقل الشعري لأعلى ثم تجميدها ، مما يسمح بتحديد العصابات المطابقة لتسلسل CFTR بمسبار (براون ، 2001).

في الختام ، هذه النتائج مهمة لأنها تكشف أن HindIII هو نوكلياز داخلي مفيد للغاية لتشخيص التليف الكيسي وتشخيص التليف الكيسي لجيف (الناجم عن طفرة CFTR ∆F508) يعني أنه يمكنه تلقي العلاج الشخصي ، lumacaftor ، على سبيل المثال ، هو دواء قد يفيد جيف من خلال منع تدهور بروتينات CFTR المشوهة التي تسببها طفرة CFTR -F508 ، وهذا يساعد البروتينات على الوصول إلى سطح الخلية الظهارية القمية بحيث يمكن استعادة هذه الوظيفة جزئيًا (Kreda et al. 2012). يمكن تحسين هذه التجربة بمضاعفة عدد العينات للتأكد من أن العينات لم تتلوث من قبل نوكلياز تقييد غير صحيح وباستخدام خط اتجاه مختلف ينتج معادلة تحسب الأحجام الجزيئية بدقة محسنة. يمكن أن تستكشف الدراسات المستقبلية تطبيق نوكليازات تقييدية أخرى مثل BamHI و EcoRII و Hand HaeIII لترى كيف يقطعون CFTR في الضوابط الإيجابية والسلبية.

مراجع

براون ، تي (2001) النشاف الجنوبي. مناعة بروتوك بالعملة 10 (6 أ).

كوني ، أل ، بي بي. ماكراي جونيور ، وبي. Sinn (2018) العلاج الجيني للتليف الكيسي: النظر إلى الوراء والتطلع إلى الأمام. الجينات (بازل) 9 (11).

كاتينج ، جي آر (2015) جينات التليف الكيسي: من الفهم الجزيئي إلى التطبيق السريري. نات ريف جينيه 16 (1): 45-56.


3 من التشخيص عبر الأعراض إلى فحص التليف الكيسي عند حديثي الولادة

إذا لم يتم تشخيص التليف الكيسي ولم يتم علاجه في وقت مبكر من الحياة ، فقد يكون توسع القصبات الحاد موجودًا بالفعل عند التشخيص. على الرغم من أعراض مثل السعال المزمن ، أو ضعف زيادة الوزن أو المضاعفات بسبب سوء التغذية ، فإن متوسط ​​العمر عند التشخيص يتراوح من بضعة أشهر إلى عدة سنوات. 4 إن إجراء التشخيص بعد أسابيع قليلة من الحياة قد فات الأوان بالفعل لتحقيق أفضل النتائج. 22 في التليف الكيسي ، تعد الوقاية من تطور مرض الرئة ومضاعفاته أمرًا أساسيًا ، ولكن لا يزال الأمر يستغرق عدة عقود لإثبات أن التليف الكيسي كان مرضًا يلائم معايير فحص حديثي الولادة. نحن نعلم الآن أن فوائد فحص حديثي الولادة من التليف الكيسي تفوق الضرر وأن فحص التليف الكيسي حديثي الولادة يؤدي إلى بقاء أفضل. 23

بدأ فحص التليف الكيسي حديثي الولادة بقياس التربسينوجين المناعي في الدم في بقعة دم جافة. لكن هذه الاستراتيجية كانت لها قيمة تنبؤية إيجابية منخفضة ، بحوالي 10٪ ، وكان لا بد من استدعاء المرضى لإجراء اختبار ثانٍ. مضيفا الكشف الأكثر تكرارا CFTR أدت الطفرات في قياس التربسينوجين المناعي إلى تحسين القيمة التنبؤية الإيجابية لفحص التليف الكيسي حديثي الولادة ، وهذه هي الاستراتيجية المفضلة الآن في معظم البلدان. 24 يجب اتباع اختبار فحص إيجابي بإثبات التشخيص عن طريق اختبار العرق الإيجابي (كلوريد العرق & gt60 ملي مول / لتر) أو وجود طفرتين تسبب التليف الكيسي. 2

في الوقت الحالي ، تم إجراء فحص حديثي الولادة في جميع أنحاء البلاد في جميع البلدان الأوروبية تقريبًا ، في الولايات المتحدة وكندا وأستراليا وحتى في روسيا وتركيا والبرازيل. يتم تفويت بعض الحالات عن طريق فحص حديثي الولادة من التليف الكيسي. يجب أن تسعى الخوارزميات للحصول على حساسية أعلى من 95٪ وقيمة تنبؤية إيجابية أعلى من 30٪. 25 يتمثل الأثر الجانبي الرئيسي لفحص حديثي الولادة في التليف الكيسي في الكشف عن الأطفال الذين لا يمكن إجراء تشخيص التليف الكيسي أو استبعادهم على وجه اليقين. هؤلاء الأطفال ، الذين تم تصنيفهم على أنهم حاصلون على تشخيص إيجابي غير حاسم في شاشة التليف الكيسي ، لا يعانون من أعراض ولكن هناك حاجة إلى المتابعة لاكتشاف الأقلية التي ستصاب بأعراض التليف الكيسي ، والتي تبلغ حوالي 10 ٪. 26

في المناطق التي لها تاريخ طويل في فحص حديثي الولادة من التليف الكيسي المرتبط باكتشاف الناقل ، يتناقص معدل حدوث التليف الكيسي بسبب الفحص المتسلسل في الأقارب والاستشارات السابقة للحمل. 27


إصلاح التليف الكيسي عن طريق تصحيح مجموعة مجال CFTR

بالنسبة لمرضى التليف الكيسي (CF) ، تركز معظم العلاجات على تخفيف أعراض المرض. ومع ذلك ، فقد تمت دراسة الأساس الخلوي للمرض جيدًا ، حيث يمكن للطفرات في جين التليف الكيسي أن تضعف الطي والإفراز واستقرار سطح الخلية و / أو وظيفة قناة كلوريد CFTR. كان تصحيح هذه العيوب الأساسية تحديًا ، لكنه يشير إلى أن الفهم الأعمق للآلية الجزيئية والخلوية للطفرات هو شرط أساسي لتطوير علاجات أكثر كفاءة.

التليف الكيسي هو مرض وراثي وراثي متنحي مع حدوث & # x0223c1 في 2500 من القوقازيين ، ويؤثر على & # x0223c70،000 شخص في أمريكا الشمالية وأوروبا (ريوردان ، 2008). تشمل السمات السريرية قصور البنكرياس ، وعقم الذكور ، والعلوص العقي عند حديثي الولادة ، وعدوى الرئة المزمنة مع الالتهاب المفرط ، مما يؤدي إلى تدهور تدريجي في وظائف الرئة (زيلينسكي ، 2000). يعد فقدان وظائف الرئة السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى التليف الكيسي. تعالج معظم العلاجات الحالية أعراض هذه الجوانب من المرض وزادت متوسط ​​العمر المتوقع للأفراد المصابين بالتليف الكيسي إلى & # x0223c39 سنة (Ashlock and Olson ، 2011).

في عام 1989 ، تم عزل جين CF الذي يشفر منظم توصيل غشاء التليف الكيسي (CFTR) ، وهو عضو في عائلة ناقل ABC (Rommens et al. ، 1989). تم تحديد أكثر من 1900 طفرة في جين التليف الكيسي (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr). يتكون CFTR ، وهو بروتين غشائي متعدد التنظير ، من خمسة مجالات: مجالان لربط النوكليوتيدات (NBDs) ، ومجالان ممتدان للغشاء (MSDs) ومنطقة تنظيمية (R) (ريوردان ، 2008). أظهرت الدراسات البيوكيميائية والبيولوجية الخلوية والوظيفية أن CFTR عبارة عن قناة كلوريد تنظمها ATP والفسفرة (Riordan et al. ، 1989). ينحصر CFTR في غشاء البلازما القمي للظهارة الإفرازية في الشعب الهوائية والأمعاء والبنكرياس والخصية والغدد الخارجية ، بالإضافة إلى الكلوريد ، ينقل البيكربونات وينظم ناقلات الأيونات الأخرى (Gadsby et al. ، 2006).

ما هو الخطأ في CFTRs متحولة؟

تم تصنيف طفرات التليف الكيسي في ست فئات بناءً على مسبباتها الخلوية / الجزيئية (Zielenski ، 2000). تشتمل طفرات الفئة الأولى على طفرات غير منطقية (G542X و R553X) ، مما يؤدي إلى توليد رموز إنهاء مبكرة وطفرات تحول الإطار التي تؤدي إلى بروتين مبتور و / أو غير وظيفي (الشكل 1). تتسبب طفرات الفئة V في سوء الربط أو التداخل مع نشاط المروج. كلا الفئتين يضعفان إنتاج بروتين CFTR وتعبير غشاء البلازما ، مما يتسبب في النمط الظاهري لـ CFTR الشديد.

الآلية الخلوية والعلاجات للفئات السائدة من الطفرات المسببة للتليف الكيسي. (أ) طفرات الفئة الأولى (على سبيل المثال ، G542X) تضعف إنتاج بروتين CFTR كامل الطول عن طريق تحريض أكواد الإنهاء المبكر (PTC). يمكن للأمينوغليكوزيدات والعقار التجريبي ، Ataluren ، إنقاذ هذا النمط الظاهري عن طريق تحفيز قراءة PTC والسماح بترجمة بروتين CFTR كامل الطول. (ب) الطفرة الأكثر شيوعًا & # x00394F508 (الفئة الثانية) تضعف النضج المطابق للقناة ويتم التعرف على CFTR غير المطوي بواسطة نظام مراقبة الجودة الشبكي الإندوبلازمي (ER) ويستهدف التدهور عبر نظام ubiquitin & # x02013proteasome. يمكن للمصححين (على سبيل المثال ، VX-809) إنقاذ المعالجة الخاطئة جزئيًا ، ربما عن طريق تحسين الطي في ER وتأخير دوران غشاء البلازما (PM) بآلية غير مفهومة حاليًا. على الرغم من أن & # x00394F508-CFTR يحتفظ بوظيفة قناة Cl & # x02212 الجزئية ، إلا أنه غير مستقر من حيث التوافق ويتم التخلص منه بواسطة نظام PM QC عبر التسليم الليزوزومي المعتمد على الانتشار (Okiyoneda et al. ، 2010). (C) طفرات الفئة الثالثة (على سبيل المثال ، G551D) لا تؤثر على التخليق الحيوي CFTR وتعبير PM ، ولكنها تضعف قناة القناة. محفزات CFTR ، بما في ذلك Ivacaftor المعتمدة من FDA ، تصحح هذا النمط الظاهري.

طفرات الفئة الثانية ، على الرغم من مستويات النسخ العادية ، لديها القليل من CFTR القابل للاكتشاف أو لا يوجد على الإطلاق في غشاء البلازما نتيجة سوء تشكيل البولي ببتيد المترجم حديثًا. تتضمن هذه الفئة الطفرة الأكثر شيوعًا ، وهي حذف فينيل ألانين 508 (& # x00394F508) في NBD1 ، والتي يمكن تحديدها في أحد الأليلين أو كليهما في & # x0223c90٪ من مرضى التليف الكيسي (ريوردان ، 2008). & # x00394F508-CFTR يتم الاحتفاظ به إلى حد كبير في ER ويتدهور بواسطة نظام ubiquitin & # x02013proteasome (الشكل 1 Cheng et al. ، 1990 Ward et al. ، 1995).

طفرات الفئة الثالثة (على سبيل المثال ، G551D ، & # x0223c4٪) والفئة الرابعة (على سبيل المثال ، R117H) تعطل دورة فتح وإغلاق قناة CFTR (أو البوابة) والتوصيل ، على التوالي ، دون عيوب مطابقة أو الاتجار. ترتبط طفرات الفئة الثالثة بشكل أساسي بـ NBD1-2 ، في حين يتم ترجمة طفرات الفئة الرابعة إلى مسام القناة (ريوردان ، 2008). تقلل طفرات الفئة السادسة من تعبير CFTR عن طريق تسهيل إزالة القناة من غشاء البلازما. والجدير بالذكر أن بعض الطفرات لها نمط ظاهري مختلط. على سبيل المثال ، تسبب طفرة & # x00394F508 في الطي والبوابة ، بالإضافة إلى ضعف استقرار غشاء البلازما (Dalemans et al. ، 1991 Denning et al. ، 1992 Lukacs et al. ، 1993).

تصحيح العيوب الأساسية

نظرًا لأن التليف الكيسي هو مرض أحادي الجين ، فمن المفترض أن يتم تخفيف النمط الظاهري السريري عن طريق تصحيح العيوب الأساسية التي تسببها الطفرات المختلفة التي تعيق أو تمنع وظيفة CFTR أو التعبير أو كليهما (Cai et al. ، 2011). تركزت الجهود المبذولة لتصحيح العيوب الأساسية للتكوين الحيوي CFTR والوظيفة بشكل أساسي على الطفرات الأكثر انتشارًا: & # x00394F508 ، G551D ، وكودونات الإنهاء المبكر (الشكل 1).

قراءة أكواد الإنهاء المبكر.

تتفاعل الأمينوغليكوزيدات مثل الجنتامايسين مع الرنا الريباسي حقيقيات النواة داخل الوحدات الفرعية الريبوزومية وتقلل من دقة الترجمة عن طريق مقاطعة وظيفة التدقيق اللغوي العادية (Burke and Mogg ، 1985). وبالتالي ، تسمح aminoglycosides بإدخال حمض أميني قريب في كودون إنهاء مبكر وترجمة منطقة التشفير بأكملها. تم استخدام الأمينوغليكوزيدات لقمع أكواد الإنهاء المبكر ، مما أدى إلى تخليق CFTR كامل الطول في مرضى التليف الكيسي مع طفرات من الفئة الأولى (Wilschanski et al. ، 2003). تم تطوير Ataluren (PTC124) ، وهو دواء متوفر بيولوجيًا عن طريق الفم مع سمية متناقصة ، بواسطة اختبار فحص عالي الإنتاجية يعتمد على الخلية (Welch et al. ، 2007). على الرغم من أن Ataluren يقمع بشكل انتقائي كودون الإنهاء المبكر في نموذج الفأر (Welch et al. ، 2007) ، إلا أنه أظهر كفاءة متغيرة بين المرضى الذين لديهم أنماط وراثية مختلفة (Rowe et al. ، 2007). تم الإبلاغ عن Ataluren الذي يتم تناوله عن طريق الفم لإنقاذ نشاط CFTR مع أكواد الإنهاء المبكر في تجارب المرحلة الثانية (Kerem et al. ، 2008 Sermet-Gaudelus et al. ، 2010). تجري حاليًا دراسة سريرية للمرحلة الثالثة لتقييم الفعالية والسلامة على المدى الطويل (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/ <"type": "Clinical-trial"، "attrs": <"text": " NCT00803205 "،" term_id ":" NCT00803205 ">> NCT00803205).

هل & # x00394F508-CFTR قابلة للطي والمعالجة والعيوب الوظيفية قابلة للتصحيح؟

من حيث المبدأ ، يمكن إبطال عيب الطي CFTR عن طريق المرافقين الدوائيين (أجهزة الكمبيوتر) ، على غرار أمراض سوء القولبة الأخرى ، حيث يمكن لمجموعة متنوعة من الروابط أو الركائز أن تثبت التشكل الوظيفي للبروتين المستهدف (بيرنييه وآخرون ، 2004). على الرغم من أن هذا النهج سيكون محددًا للغاية ، ويحافظ على التنظيم الداخلي ونمط التعبير لـ CFTR ، إلا أن روابط CFTR عالية التقارب غير متوفرة. يمكن أيضًا استغلال تغيير بيئة الطي الخلوي للتغلب على سوء التشكيل الطافر / المعالجة الخاطئة وقد أظهر بعض النجاح في الإعدادات قبل السريرية (Balch et al. ، 2011). يمكن للمرافقين الكيميائيين المشابهين لدرجة الحرارة المنخفضة أيضًا مواجهة اختلال & # x00394F508-CFTR وإثارة التراكم المتواضع للقنوات الوظيفية جزئيًا ولكن غير المستقرة في غشاء البلازما (Denning et al. ، 1992 Sato et al. ، 1996 Sharma et al. ، 2001) .

دفع الكشف عن إمكانية إنقاذ & # x00394F508-CFTR إلى تطوير اختبار فحص عالي الإنتاجية قائم على الخلية باستخدام بروتين الفلورسنت الأصفر ومؤشر هاليد # x02013 ، الذي يراقب نفاذية كلوريد غشاء البلازما المنشط بواسطة cAMP ، بما في ذلك نشاط CFTR ، عن طريق استشعار التغيرات في تركيز هاليد السيتوبلازم (Galietta et al. ، 2001). أصبح هذا الفحص مفيدًا في تحديد ليس فقط & # x0201ccorrectors & # x0201d التي تعمل على تحسين & # x00394F508-CFTR تعبير غشاء البلازما ، ولكن أيضًا & # x0201c محفزات & # x0201d لتنشيط غشاء البلازما & # x02013r المقيم قنوات CFTR. ومن المثير للاهتمام ، أن الفحص حدد أيضًا مثبطات قنوات الكلوريد ، والتي قد تكون علاجات محتملة في الإسهال الإفرازي (Verkman and Galietta ، 2009).

أنتج فحص المكتبات الكيميائية المتنوعة عدة فئات من مصححات الجزيئات الصغيرة & # x00394F508-CFTR ، بما في ذلك corr-4a ونظائرها (Pedemonte et al. ، 2005a). تم الحصول على مصححات إضافية أيضًا من خلال طرق الفرز والحساب عالية الإنتاجية (Kalid et al. ، 2010 Robert et al. ، 2010 Sampson et al. ، 2011). ومع ذلك ، فإن فعالية هذه المصححات في استعادة توصيل الكلوريد كانت محدودة ووصلت فقط إلى & # x0003c10 ٪ من ظهارة الإنسان الأولية الطبيعية ، وهو أقل بكثير من المتطلبات المتوقعة للكفاءة العلاجية (Pedemonte et al.، 2005a، 2010 Van Goor et al. ، 2006). نهج مماثل من قبل Vertex Pharmaceuticals ، Inc. مع علاجات مؤسسة التليف الكيسي & # x02019s (CFFT) أسفر عن فئات جديدة من المصححات ، بما في ذلك VX-809 ، المركب الواعد الذي يتم تقييمه في المرحلة الثالثة من التجارب السريرية (Van Goor et al. ، 2006 ، 2011). يستعيد VX-809 & # x0223c15٪ نشاط قناة CFTR في ظهارة الجهاز التنفسي الأولية التي تعبر عن & # x00394F508-CFTR ، ولكن يبدو أن لها فوائد سريرية هامشية (Van Goor et al. ، 2011 Clancy et al. ، 2012).

إعادة تنشيط قنوات غشاء البلازما المعيبة CFTR.

كما قامت فحوصات الفرز الوظيفية عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلية بعزل العديد من المحفزات التي تعمل على تحسين وظيفة القناة لطفرات الصنفين الثاني والثالث (Pedemonte et al. ، 2005b Van Goor et al. ، 2006). المحفز الواعد ، VX-770 (Ivacaftor) ، المعزول بواسطة Vertex Pharmaceuticals ، Inc. ، يعيد نشاط G551D-CFTR إلى & # x0223c50 ٪ من مستوى النوع البري (Van Goor et al. ، 2009). أكدت الدراسات السريرية السلامة على المدى القصير والفوائد السريرية ، بما في ذلك انخفاض معدل تفاقم الرئة بنسبة 55٪ وزيادة وظائف الرئة بنسبة 10٪ (Ramsey et al.، 2011). Ivacaftor هو أول دواء معتمد من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لعلاج مرضى G551D-CFTR (& # x0223c4 ٪ من سكان التليف الكيسي) ، وهو يمثل إنجازًا ترجميًا بارزًا ، ويستغل البيولوجيا الأساسية لـ CFTR وسنوات من البحث والتطوير في كل من الأوساط الأكاديمية والصناعية. بشكل ملحوظ ، يعيد Ivacaftor أيضًا عيب البوابات للعديد من طفرات الفئة الثانية الأخرى ، وبالتالي ، قد يفيد & # x0223c10 ٪ من مرضى التليف الكيسي (Yu et al. ، 2012).

يمكن أن يكون العلاج المركب من المحفزات والمصححات مفيدًا لتحسين وظيفة & # x00394F508-CFTR نظرًا للعيب المستمر في البوابة التي تم إنقاذها & # x00394F508-CFTR في غشاء البلازما. في الواقع ، تشير النتائج المؤقتة لتجربة سريرية من المرحلة الثانية إلى أن & # x00394F508 مرضى CF الذين عولجوا بمزيج من VX-809 و Ivacaftor يبدو أنهم يظهرون وظائف رئوية أفضل من أولئك الذين عولجوا بأي من العقاقير بمفرده (http://clinicaltrials.gov/ct2 / show / <"type": "Clinical-trial"، "attrs": <"text": "NCT01225211"، "term_id": "NCT01225211" >> NCT01225211).

التحديات المقبلة: العلاج الفعال لـ & # x00394F508-CFTR

على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث CFTR ، فإن المزيد من التحسين في التعبير الوظيفي لـ & # x00394F508-CFTR ، الطفرة الأكثر شيوعًا في مرضى التليف الكيسي ، ضرورية لأن تصحيح النمط الظاهري للتليف الكيسي يتطلب على الأرجح استعادة & # x0223c35 ٪ من نشاط غشاء البلازما CFTR من النوع البري . يجب أن يساعد توضيح طي / سوء تشكيل CFTR وآليات التصحيح المتاحة في تحقيق هذا الهدف. هنا ، نركز على الجهود المبذولة لفهم وتصحيح عيوب الطي لـ & # x00394F508-CFTR.

طي المجال CFTR وإخفاقه.

يدعم الدليل المقنع نموذج طي المجال المقترن لـ CFTR. وفقًا لذلك ، يمكن للمجالات الفردية أن تطوى cotranslationally إلى الحالات غير المستقرة ولكن تحقيق الطية الأصلية CFTR يتطلب تجميع مجال ما بعد الترجمة والتفاعلات بين المجالات التي تعتبر حاسمة للطي المناسب (الشكل 2 A Du et al. ، 2005 He et al. ، 2008 ، 2010 Du and Lukacs، 2009). يتم مساعدة النضج المطابق البطيء بعد الترجمة بواسطة المرافقين (Rosser et al. ، 2008) وينعكس من خلال التكوين المتأخر لواجهات NBD & # x02013MSD في النوع البري الناضج CFTR (He et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008 ).يساهم عدم الاستقرار النشط للمجالات الفردية وتجميع المجال البطيء مع حركيات التحلل السريع المرتبطة بـ ER للوسائط القابلة للطي في الطي غير الفعال (& # x0223c30 ٪) من النوع البري CFTR (الشكل 2 ب) ويزيد من توعية بواسطة الطفرات النقطية في التليف الكيسي (رابح وآخرون ، 2012).

نماذج عمل لطي CFTR ، وسوء تشكيل ، وآلية تصحيح & # x00394F508-CFTR بواسطة المرافقين الدوائية. (أ) نماذج الطي والتشكيل الافتراضية لقناة CFTR متعددة المجالات. يتم طي كل مجال CFTR ، مثل MSD1 و NBD1 و MSD2 و NBD2 (M1 و N1 و M2 و N2) ، إلى نطاقات متغيرة بشكل مشترك لتشكيل حالات غير مستقرة. يعمل تشكيل واجهات المجال & # x02013 على تسهيل المزيد من الطي والتجميع للمجال المقترن ، وهو شرط أساسي للهيكل الثلاثي الأصلي CFTR. يشار إلى الثبات الحراري التدريجي للمجالات الفردية أثناء الطي المشترك وما بعد الترجمة بواسطة الألوان الزائفة. & # x00394F508 طفرة (& # x00394) يضعف كل من NBD1 الطاقة وتفاعلات المجال & # x02013domain (خاصة عبر واجهة NBD1 & # x02013MSD2) بسبب العيوب التوافقية والطوبولوجية ، مما يجعل جميع المجالات الأربعة الرئيسية معطلة هيكليًا في & # x00394F508-CFTR. مقتبس من رابح وآخرون. (2012) بإذن من Elsevier. (ب) الإنقاذ الجيني لعيب الطي & # x00394F508-CFTR. يحقق الاستقرار التدريجي لـ & # x00394F508-NBD1 بواسطة لوحة من الطفرات الكابتة (على سبيل المثال ، 3S) تحسنًا متواضعًا فقط في كفاءة الطي الهامشي لـ & # x00394F508-CFTR (& # x0223c0.4٪). تم الحصول على نقاط البيانات التمثيلية والارتباطات بين ثبات NBD1 وطي CFTR من Rabeh et al. (2012). تسببت التغييرات المماثلة في الاستقرار المطابق لـ WT NBD1 (على سبيل المثال ، 3S) في زيادة مضاعفة تقريبًا في كفاءة طي WT CFTR. استعاد استقرار واجهة NBD1 & # x02013MSD2 بواسطة طفرات مثبط الموقع الثاني (على سبيل المثال ، R1070W) إلى حد كبير كفاءة اقتران تشبه WT بين استقرار NBD1 و & # x00394F508-CFTR قابلة للطي (رابح وآخرون ، 2012). يشير هذا إلى أن تصحيح عيبين هيكليين متميزين ضروري لتحقيق استعادة قوية لطي ووظيفة & # x00394F508-CFTR. (C) الميزات المتوقعة لعمليات الإنقاذ الدوائية & # x00394F508-CFTR بواسطة مصححات هيكلية محددة للعيوب. نتوقع أن مجموعة فرعية من المصححات ، لم يتم تحديدها بعد ، حيث يمكن للمرافقين الدوائية إما تثبيت NBD1 (1 ، خط متقطع أزرق) و / أو واجهة NBD1 & # x02013MSD2 (2 ، خطوط حمراء متقطعة) عبر الارتباط المباشر بـ & # x00394F508 -CFTR. قد ينتج عن المركب الفردي زيادة متواضعة في كفاءة الطي المتحولة ، ولكن الأزواج التكميلية التي تستهدف كل من العيوب الهيكلية الأولية ستعمل بشكل تآزري على تحسين الطي & # x00394F508-CFTR ، والتعبير PM ، والوظيفة المشابهة لطفرات القامع. كمرجع ، يشار إلى كفاءة الطي WT- و & # x00394F508-CFTR (خطوط سوداء).

كيف تؤثر طفرة & # x00394F508 على القناة؟ كشفت تجارب النمذجة المتماثلة والربط المتبادل للسيستين عن البنية الفريدة ثلاثية الأبعاد لـ CFTR والدور المحتمل لـ F508 (He et al. ، 2008 Mornon et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008). في CFTR الأصلي ، تشكل بقايا F508 والمنطقة المحيطة في NBD1 واجهة مع حلزون اقتران الحلقات السيتوبلازمية 4 (CL4) و 1 (CL1) في MSD2 و MSD1 ، على التوالي ، مما يخلق رقعة كارهة للماء. يرتبط NBD2 بـ CL2 و CL3 لـ MSD1 و MSD2 ، على التوالي. تنقل هذه الواجهات التغييرات المطابقة لـ NBDs إلى MSDs أثناء بوابة القناة ، وهي ضرورية لطي CFTR (Wang et al. ، 2007 He et al. ، 2008 ، 2010 Mornon et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008 Loo et al.، 2010 Thibodeau et al.، 2010 Grove et al.، 2011). يؤدي زعزعة استقرار الواجهة عن طريق الطفرات الخاطئة في CLs أو عن طريق الطفرات في السلسلة الجانبية F508 إلى تعطيل الطي (Du et al.، 2005 Mornon et al.، 2008 He et al.، 2010 Loo et al.، 2010 Thibodeau et al.، 2010). تدعم هذه الملاحظات النموذج الناشئ للنضج المطابق لما بعد الترجمة لـ CFTR الذي يتضمن استقرار المجال النشط و / أو الحركي أثناء طي المجال المقترن (Du and Lukacs ، 2009) ، على غرار نموذج متعدد قابل للذوبان. بروتينات المجال وناقل BtuCD (الشكل 2 A Han et al. ، 2007 DiBartolo and Booth ، 2011).

استهداف أكثر من عيب واحد في الطي في & # x00394F508-CFTR.

كشفت الدراسات الحديثة أن & # x00394F508-NBD1 غير مستقر ديناميكيًا وحركيًا عند درجة الحرارة الفسيولوجية ، واقترحت أن استقرار NBD1 سيعوض المعالجة الخاطئة & # x00394F508-CFTR (Protasevich et al. ، 2010 Wang et al. ، 2010). والمثير للدهشة أن الأمر لم يكن كذلك. حتى الاستقرار المطابق الكبير لـ & # x00394F508-NBD1 بواسطة طفرات الموقع الثاني أدى إلى إنقاذ متواضع (& # x0003c20 ٪) من معالجة & # x00394F508-CFTR ، وتعبير غشاء البلازما ، والوظيفة ، وفشل في إعادة طي المجال المقترن (الشكل 2). B Mendoza et al.، 2012 Rabeh et al.، 2012). وبالمثل ، فإن عكس عدم استقرار واجهة NBD1 & # x02013MSD2 عن طريق طفرات الموقع الثانية (على سبيل المثال ، R1070W) فقط بشكل هامشي أنقذ & # x00394F508-CFTR النمط الظاهري (الشكل 2 ب). بشكل ملحوظ ، أدى التثبيت الجيني المتزامن لطاقة NBD1 وواجهة NBD1 & # x02013MSD2 إلى إنقاذ قوي وتآزر (65 & # x0201380 ٪) من & # x00394F508-CFTR للطي والوظيفة (الشكل 2 ب رابح وآخرون ، 2012). تم التوصل إلى استنتاج مماثل من خلال تحليل التسلسلات المتطورة المقترنة ببقايا F508 (Mendoza et al. ، 2012). تشير هذه النتائج غير المتوقعة إلى أن تصحيح عيبين بنيويين أساسيين ضروري وكاف لاستعادة وظيفة CFTR في معظم مرضى التليف الكيسي.

الآثار المترجمة لآلية اختلال & # x00394F508-CFTR

أبرز اكتشاف عيبين أساسيين في الطي في & # x00394F508-CFTR ثلاثة آثار دوائية (الشكل 2 ج): (1) توفر عيوب الطي الجمع تفسيراً معقولاً للفعالية المتواضعة للمصححات الفردية التي قد تستهدف واحدًا منهم فقط باستخدام آلية (آليات) غير معروفة حاليًا (Sampson et al. ، 2011 Van Goor et al. ، 2011) (2) يمكن لطفرات الموقع الثانية التي تتصدى لأحد عيوب الطي الأولية أن تعزز التصنيف الميكانيكي لجزيئات المصحح الموجودة ، بالإضافة إلى تحديد الجديدة من الجيل الثاني من العيوب الهيكلية & # x02013 مقايسات الفحص عالية الإنتاجية المستهدفة (3) من المحتمل أن يكون تصحيح كل من NBD1 النشط والواجهة مطلوبًا لتطبيع & # x00394F508-CFTR المعالجة والتعبير والوظيفة (الشكل 2 ج). ما إذا كان يمكن تحقيق ذلك عن طريق واحد أو اثنين من الجزيئات الصغيرة وحدها ، أو بالاشتراك مع منظمات شبكة البروتيوستاس التي تعدل بشكل غير مباشر طي & # x00394F508-CFTR ، والاتجار ، والوظيفة (Balch et al. ، 2011) في انتظار مزيد من التجارب.

التحديات الرئيسية الأخرى للترجمة

في هذا البحث ، وصفنا العواقب الخلوية لطفرات CFTR والجهود الأخيرة لفهم عيوب الطي الكامنة وراء طفرة & # x00394F508-CFTR من أجل تحسين طي القناة واستقرارها ووظيفتها. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من القضايا الحاسمة. إن فهمنا للكيفية التي يؤدي بها فقدان وظيفة القناة إلى التليف الكيسي ، وخاصة أعراض الرئة ، غير مكتمل (Ashlock and Olson ، 2011) ويتفاقم بسبب حقيقة أن نماذج الفئران تفشل في تلخيص مرض الرئة التليف الكيسي ، على الرغم من تطور الخنازير المعدلة وراثيًا و قد تعالج نمس هذه المشكلة (روجرز وآخرون ، 2008 صن وآخرون ، 2010). يتم إعاقة الدراسات الميكانيكية للقناة بسبب انخفاض عدد النسخ وعدم استقرار المسوخ والصعوبات في مراقبة التغيير الهيكلي والبروتين وتفاعل البروتين # x02013 والاتجار بدقة عالية زمانية مكانية في البيئة الخلوية المناسبة (Riordan، 2008 Balch et al.، 2011). بالإضافة إلى برامج اكتشاف الأدوية الموضحة في هذه الورقة ، هناك جهود مستمرة لاستبدال الطفرة بالعلاج الجيني و / أو تنشيط إفراز الكلوريد البديل. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية المتعددة تعيق التوصيل النووي للجين المحور CFTR المعبأ إما في مجمعات دهنية كاتيونية أو فيروسات ، على الرغم من أن التغلب على هذه العمليات قد يسمح بعلاج مستقل عن النمط الجيني (Griesenbach and Alton ، 2009). فتح تحديد الشكل الإسوي الظهاري لقناة الكلوريد المنشط Ca 2+ (TMEM16A) إمكانية التنشيط الدوائي لمسار إفراز كلوريد بديل (Ferrera et al. ، 2010).

يعتمد النجاح النهائي للبحث المترجم غالبًا على فهمنا التفصيلي للمشكلة البيولوجية الأساسية المطروحة. نأمل أن يساعد هذا المنظور القصير في إلهام المزيد من الأبحاث البيولوجية ، وهو شرط أساسي للنجاحات الانتقالية في علاج العيوب الأساسية في التليف الكيسي والأمراض الوراثية الأخرى مثل السكري الكاذب وفرط كوليسترول الدم العائلي.


العوائق والاتجاهات المستقبلية للطب الدقيق للوصول إلى جميع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي

أصبحت مُعدِّلات CFTR طرقًا علاجية تحويلية للعديد من مرضى التليف الكيسي ، كما هو مذكور أعلاه. على الرغم من الإنجازات العديدة ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لمواصلة تحسين العلاجات وتحديد المُعدِّلات الجديدة للمرضى الذين يحملون طفرات CFTR نادرة أو نادرة جدًا أو حتى فريدة من نوعها ، والذين لا يزالون يواجهون حاجة غير ملباة للعلاجات التصحيحية الفعالة. علاوة على ذلك ، لا تزال بعض الحواجز تشكل تحديات كبيرة في التوفر العادل لهذه العلاجات الدوائية ، بما في ذلك التكاليف الباهظة والقضايا التنظيمية الوطنية. كانت البيئة التعاونية المكونة من باحثين أكاديميين ومتخصصين في الرعاية الصحية وشركات الأدوية وممثلي المرضى حاسمة في تطوير علاجات أفضل للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي.

الاستمرار في تحسين الأنظمة العلاجية لزيادة الالتزام وتقليل العبء

تتطلب الطبيعة متعددة الأوجه للتليف الكيسي أنظمة علاجية معقدة وتستغرق وقتًا طويلاً ويجب تكييفها بشكل دوري وفقًا لتطور المرض. علاوة على ذلك ، يخضع مرضى التليف الكيسي لأعباء إكلينيكية ونفسية واقتصادية كبيرة ، مما يشكل تحديات لتحقيق الالتزام الأمثل بالعلاج مدى الحياة. يختلف الالتزام إلى حد كبير اعتمادًا على نوع العلاج وطريقة الإعطاء والمدة وعدد الأدوية المميزة ، بالإضافة إلى عمر المريض والحالة الاجتماعية والاقتصادية (Sawicki et al.، 2013 Angelis et al.، 2015 Quittner et al.، 2016 Narayanan et آل ، 2017). علاوة على ذلك ، يقضي مرضى التليف الكيسي عادة مرتين و 20 مرة في أنشطة العلاج اليومية أكثر من مرضى السكري والربو ، على التوالي (Ziaian et al. ، 2006) ، مما قد يؤثر بشكل كبير على الالتزام. ارتبط ضعف الالتزام أيضًا بارتفاع تكاليف الرعاية الصحية ، وزيادة تواتر الاستشفاء ، وسوء نوعية الحياة والمظاهر السريرية (Sawicki et al.، 2013 Quittner et al.، 2016 Narayanan et al.، 2017). قد يكون إنشاء علاقة أوثق بين المريض والأسر / مقدمي الرعاية وفريق الرعاية الصحية متعدد التخصصات خطوة أولى للتغلب على العوائق الرئيسية التي تحول دون الالتزام بالعلاج.

حتى الآن ، قام عدد قليل فقط من المنشورات بتقييم الالتزام بعلاج ivacaftor ولا يزال يتعين إثبات الالتزام بتركيبات المغير. من منظور سريري ، من المفترض أن يؤخذ الدواء الفموي الذي يغير الحياة مع جدول الجرعات البسيط على النحو الموصوف. ومع ذلك ، فقد تفاوت الالتزام بالإيفاكافتور من دون المستوى الأمثل (سيراكوزا وآخرون ، 2015) إلى الأمثل (سوثوف وآخرون ، 2016). نظرًا لأن هذه الدراسات كانت ذات حجم عينة صغير وطبقت طرقًا متميزة ، فلا يزال من الصعب استقراء النتائج على نطاق أوسع من سكان التليف الكيسي ، وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعالجة هذه المشكلة بشكل أفضل. قد تكون بعض الفوائد العلاجية أكثر تواضعًا في بيئة العالم الحقيقي مقارنة بالتجارب السريرية ، حيث يجب على المرضى تناول هذه الأدوية عن طريق الفم باتباع توصيات محددة ، بما في ذلك النظام الغذائي لضمان امتصاص الدواء بشكل أفضل وتوافره في الجسم. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة أن الانقطاع المفاجئ للعلاج بمُحَوِّل CFTR قد يتسبب في عواقب إكلينيكية وخيمة. أدى انسحاب Ivacaftor إلى تدهور متسارع في وظائف الرئة بما يتوافق مع نوبة تفاقم رئوي في سلسلة حالة (Trimble and Donaldson ، 2018). المرضى الذين توقفوا عن العلاج باستخدام lumacaftor / ivacaftor ، ويرجع ذلك أساسًا إلى الآثار الضارة المبكرة ، أظهروا أيضًا خطرًا أكبر لتفاقم المظاهر السريرية مقارنة بالمرضى الذين استمروا في العلاج أو أولئك الذين أعادوا العلاج بعد التوقف المؤقت في دراسة واقعية (Burgel et al. ، 2020). نظرًا لأن المرضى لديهم أنماط حياة مختلفة وظروف اجتماعية واقتصادية مختلفة ، فإن تطوير التدخلات التعليمية والتحفيزية على المستوى الفردي قد يساعد في ضمان الالتزام الأمثل لتحقيق أكبر النتائج السريرية.

تمت إضافة مُعدِّلات CFTR إلى الأنظمة العلاجية للمرضى المؤهلين ، بدلاً من استبدال بعض العلاجات العرضية. يبدو أن هذا هو النهج الأمثل لمعظم مرضى التليف الكيسي ، على الرغم من أنه يزيد أيضًا من عبء الأدوية المستخدمة. بمجرد إثبات سلامة وفعالية العلاجات الجديدة في البالغين ، يتم متابعة التجارب السريرية الإرشادية لتقييم الآثار على المرضى الأصغر سنًا ، حيث قد تختلف الآثار الضارة باختلاف الفئات العمرية (Davies et al. ، 2016 Rosenfeld et al. ، 2018 McNamara et al.، 2019 Rosenfeld et al.، 2019). قد يوفر بدء هذه العلاجات التحويلية في شدة مرض أكثر اعتدالًا وفي وقت مبكر من الحياة فرصًا أكبر لتحسين النتائج طويلة المدى بشكل كبير أو حتى منع إصابة معينة للأعضاء المصابة ، مما قد يؤدي أيضًا إلى تقليل عبء الأدوية في منظور طويل الأجل. أظهرت بعض التقارير أيضًا أن المرضى الأصغر سنًا هم أكثر تمسكًا بالعلاجات من المراهقين والبالغين ، ربما بسبب إشراف الوالدين العالي (Quittner et al. ، 2014 Shakkottai et al. ، 2014). قد يؤدي توفير مناهج تعليمية وداعمة للأطفال الصغار وأولياء أمورهم إلى الالتزام بالعلاج الأمثل مدى الحياة. نظرًا لأنه يجب نقل المرضى من رعاية الأطفال إلى رعاية البالغين في سن معينة (بشكل عام بين 18 و 21 عامًا) ، فإن الانتقال المخطط له مفيد للغاية لتحقيق أقصى قدر من الاستقلالية ، وتقليل فرص الانقطاع في العلاجات ومواصلة تحسين نوعية حياتهم (Goralski وآخرون ، 2017).

الاستمرار في تطوير العلاجات التحويلية للوصول إلى جميع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي

ركزت معظم برامج تطوير مُعدِّلات CFTR في البداية على تصحيح طفرة F508del ، نظرًا لأن التغلب التام على العيوب في هذه الطفرة سيؤدي إلى علاج فعال لما يقرب من 82٪ من مرضى التليف الكيسي في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، لا يزال هناك 10٪ & # x201318٪ من المرضى بدون أي علاجات موجهة بواسطة CFTR. هذه النسبة أعلى في البلدان التي يكون فيها انتشار F508del أقل بكثير ، مثل البرازيل وإسرائيل وإيطاليا وتركيا (الشكل 3).

قد يؤدي تحديد مواقع الربط المفترضة للمعدِّلات الموجهة CFTR باستخدام الرؤى الجديدة لهيكل CFTR إلى تسهيل التصميم العقلاني للمركبات الجديدة ذات الخصائص الدوائية المحسنة. يستمر خط أنابيب مُعدِّلات CFTR في التوسع ، كما أن بعض برامج تطوير الأدوية الحديثة تتابع أيضًا تحديد المُعدِّلات للطفرات المسببة للتليف الكيسي الأقل شيوعًا. ومع ذلك ، فإن تحديد علاجات معينة للطفرات النادرة والنادرة للغاية يطرح العديد من التحديات بسبب التباين الكبير في الطفرات المسببة للتليف الكيسي والعدد القليل جدًا من المرضى. بالإضافة إلى المُعدِّلات الموجهة CFTR ، يمكن تعويض الخلل الوظيفي في CFTR عن طريق استهداف قنوات أيونية بديلة ، مثل ENaC (Moore and Tarran ، 2018) ، وغشاء بروتين الغشاء 16A (TMEM16A) لقناة الكلوريد المنشط بالكالسيوم (Sondo et al. ، 2014) ) ، والناقل المذاب 26A9 (SLC26A9) (Bal & # xe1zs and Mall ، 2018). قد تكون الاستراتيجيات التي تعدل هذه القنوات الأيونية البديلة علاجات فعالة لجميع المرضى ، بغض النظر عن الأنماط الجينية للتليف الكيسي. يمكن أيضًا استخدام هذه الاستراتيجيات بمفردها أو بالاشتراك مع مُعدِّلات CFTR لتعزيز النتائج السريرية. ومع ذلك ، نظرًا لأن مرضى التليف الكيسي يتعرضون بالفعل لعبء كبير من الأدوية ، يجب استغلال سمات التفاعل بين الأدوية والعقاقير لتجنب الآثار الضارة أو الآثار المثبطة لعلاج واحد على آخر. في هذا الخط ، تبين أن إيتراكونازول ، وهو مضاد للفطريات يشيع استخدامه لعلاج داء الرشاشيات القصبي الرئوي التحسسي ، يزيد بشكل كبير من التعرض الجهازي لـ تيزاكافتور وإيفاكافتور (جارج وآخرون ، 2019). يوصى بالحذر والمراقبة المناسبة عند استخدام هذه العلاجات في نفس الفترة.

قدمت التجارب التقليدية ذات التصميم الخاضع للتحكم الوهمي دليلًا على سلامة وفعالية مُعدِّلات CFTR (حبيب وآخرون ، 2019) (الجدول 1) ومع ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى بدائل في المستقبل القريب ، مع توفر المزيد من خيارات المغير و من المؤكد أن عدد المرضى الذين ليس لديهم أي علاج مغير سيقلل. علاوة على ذلك ، فإن التجارب السريرية على المرضى الأصغر سنًا والأكثر مرضًا ، وأولئك الذين يحملون طفرات نادرة في CFTR هي أكثر صعوبة بسبب حجم العينة الصغير ، ومعايير التضمين / الاستبعاد المحددة ، أو حتى لبعض التردد من جانب المحققين. تمت مناقشة استراتيجيات لتكييف تصميم التجارب وتحسينه وتقديم السرعة والفعالية ، بما في ذلك استخدام العينات المشتقة من المريض ، وحسابات الطاقة للتعويض عن أخذ العينات الجماعية ، وتجارب N-of-1 و & # x201cbasket & # x201d (Matthes et al.، 2018 Amaral et al.، 2019 Davies et al.، 2019b).

قد يكون استخدام العينات المأخوذة من المريض لإجراء تقييم مقارن لفعالية الدواء نقطة انطلاق مجدية لتحديد أفضل الأدوية المرشحة. في المختبر وتوقع حجم الاستجابات العلاجية للاختبارات السريرية التالية (Strauss and Blinova ، 2017 Amaral et al. ، 2019). في الواقع ، لوحظ استجابة سريرية كبيرة ولكن متغيرة في التجارب السريرية مع مُعدِّلات CFTR في المرضى الذين يحملون طفرة G551D واحدة على الأقل (Ramsey et al. ، 2011 Rowe et al. ، 2014) أو في مرضى متماثل الزيجوت F508del (Boyle et al. ، 2014 Wainwright et al.، 2015 Donaldson et al.، 2018a) ، مما يشير إلى أن استجابة المريض لعلاج معين لا تتأثر فقط بالنمط الجيني التليف الكيسي ولكن أيضًا بالخلفية الجينية و / أو العوامل اللاجينية. في هذا الخط ، أظهرت بعض التقارير أن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في SLC26A9 يساهم الجين في عدم التجانس في الاستجابة بين الأفراد لعلاجات مُعدِّل CFTR (Strug et al. ، 2016 Corvol et al. ، 2018). تشير هذه النتائج إلى أهمية تقييم فعالية الدواء على المستوى الفردي في العينات المأخوذة من المريض.

تقرير الاقتران في المختبر أظهر قياس وظيفة CFTR في خطوط الخلايا والميزات السريرية وجود علاقة قوية بين وظيفة CFTR وتركيز كلوريد العرق ، وبدرجة أقل ولكن لا يزال مهمًا مع وظيفة الرئة وحالة البنكرياس (McCague et al. ، 2019). تم التحقيق في الارتباطات بين الاستجابات في العينات المأخوذة من المريض والمعلمات السريرية / المؤشرات الحيوية لإنشاء تنبؤ موثوق لفعالية الدواء.تم العثور على ارتباط ثابت بين تورم العضويات المعوية الناجم عن فورسكولين ، وتركيز كلوريد العرق وقياسات التيار المعوي للرضع المصابين بالتليف الكيسي (de Winter-de Groot et al. ، 2018). على الرغم من عدم التجانس السريري لدى البالغين المصابين بالتليف الكيسي ومتماثل الزيجوت بالنسبة لطفرة F508del ، فإن تورم الأعضاء المعوية الناجم عن الفورسكولين يرتبط ارتباطًا إيجابيًا بـ FEV1 و BMI (de Winter-de Groot et al.، 2019). كما تم إثبات أن الاستجابات من العضيات المعوية مرتبطة بقياسات التيار المعوي ، وانخفاض تركيز كلوريد العرق وتحسين وظائف الرئة لدى المرضى بعد علاجات مُعدِّل CFTR (Dekkers et al.، 2016a Berkers et al.، 2019). في سلسلة التجارب N-of-1 ، تم العثور على زيادة في نقل الكلوريد المعتمد على CFTR في مزارع الخلايا الظهارية للأنف فقط في المرضى الثلاثة الذين أظهروا أيضًا انخفاضًا في تركيز كلوريد العرق بعد علاج إيفاكافتور (McGarry et al. ، 2017). علاوة على ذلك ، ارتبطت الاستجابات في الخلايا الظهارية الأنفية المتماثلة اللواقح المشتقة من المريض F508del بالتحسينات في ppFEV.1 وقياسات التيار المعوي ، ولكن ليس مع اختلاف الجهد الأنفي بعد العلاج المشترك مع lumacaftor / ivacaftor (Pranke et al. ، 2019). ومع ذلك ، لم يتم العثور على ارتباطات ذات دلالة إحصائية بين الاستجابات في قياس التيار المعوي ، وفرق الجهد الأنفي وتركيز كلوريد العرق ، على الرغم من التوافق العالي لجميع المؤشرات الحيوية المعتمدة على CFTR في دراسة أخرى تقيم العلاج المشترك مع lumacaftor / ivacaftor (Graeber et al. ، 2018 ). هناك حاجة بالتأكيد إلى مزيد من الدراسات لربط فعالية الدواء والتحقق من صحتها في العينات المأخوذة من المريض بالسمات السريرية ، وقد يؤدي تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة أيضًا إلى إثراء الاستراتيجيات في تجارب الفعالية.

في عصر الأدوية التي تستهدف العيوب الكامنة في الطفرات المسببة للتليف الكيسي ، قد يبدو تطوير علاجات الأعراض أقل جاذبية. ومع ذلك ، يجب الاستمرار في تطوير هذه العلاجات لأن معظم (إن لم يكن كل) سكان التليف الكيسي الحالي سيحتاجون إليها في مرحلة ما ، ومن غير المرجح أن تعكس مُعدِّلات CFTR إعادة تشكيل أنسجة الرئة التي تم إنشاؤها بالفعل (Davies et al.، 2019b). أظهرت دراسة حديثة أن ستة أشهر من العلاج إيفاكافتور لم تكن قادرة على تغيير ميكروبيوم مجرى الهواء بشكل كبير والعديد من قياسات الالتهاب في المرضى الذين يحملون طفرة G551D واحدة على الأقل. تشير هذه النتائج إلى أن المضادات الحيوية والأدوية المضادة للالتهابات ستظل مطلوبة للسيطرة على أعراض المرض والوقاية من المضاعفات (Harris et al. ، 2019). مع تقدم المرض ، قد يصاب المرضى أيضًا بأمراض مصاحبة وبالتالي يحتاجون إلى أنظمة علاجية أكثر تعقيدًا ، مما يضيف المزيد من الأعباء. تم إثبات أن علاج Ivacaftor يحسن وظيفة البنكرياس الخارجية بالإضافة إلى ملف إفراز الأنسولين ، مما قد يخفف أو حتى يعكس مرض السكري المرتبط بالتليف الكيسي (Hayes et al. ، 2014 Davies et al. ، 2016 Tsabari et al. ، 2016 Kelly et al. ، 2019). تم إثبات أن علاج Ivacaftor يعمل أيضًا على تحسين صحة العظام (Sermet-Gaudelus et al. ، 2016) وتشوهات الأوعية الدموية (Adam et al. ، 2016). تلخص مراجعة حديثة بشكل جيد الفهم الحالي لمعدلات CFTR بشأن المضاعفات خارج الرئة في التليف الكيسي (Sergeev et al. ، 2019). ومع ذلك ، فإن معظم الدراسات عبارة عن تقارير حالة أو حجم عينة صغير ، وهناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات للتحقيق في تأثير علاجات CFTR على الأمراض المصاحبة للتليف الكيسي.

يبدو أن العلاج بأكثر من معدل CFTR هو الأسلوب الأمثل للعديد من الطفرات المسببة للتليف الكيسي. نظرًا لأن ناقلات الزيجوت غير المتجانسة لا تظهر عليها أعراض ، فقد يكون التغلب على الخلل الوظيفي في CFTR في أليل واحد كافيًا لوقف تقدم المرض ، إذا بدأ العلاج في وقت مبكر من الحياة وقبل حدوث إصابة رئوية شديدة. مرتكز على في المختبر دليل (Zhang et al. ، 2009) ، قد يكون إنقاذ 25-50 ٪ من وظيفة WT-CFTR في كلا الأليلين كافياً أيضًا لاستعادة المعدلات الطبيعية للتخليص المخاطي الهدبي. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح عدد مُعدِّلات CFTR التي ستكون مطلوبة للوصول إلى هذه العتبة في المرضى. بالإضافة إلى مُعدِّلات CFTR ، تم إحراز تقدم في تطوير العلاجات القائمة على الخلايا (Barical et al. ، 2019 Hayes et al. ، 2019) والعلاجات الجينية (Donnelley and Parsons، 2018 Duncan et al.، 2018 Lopes-Pacheco et al.، 2018 Osman et al.، 2018) لمرض الرئة التليف الكيسي.

تحديد الحلول المجدية لتكلفة الرعاية الصحية CF مستدامة

يتمثل أحد القيود الرئيسية لهذه العلاجات الصيدلانية الجديدة لمرضى التليف الكيسي ، مثل مُعدِّلات CFTR ، في التكاليف الباهظة عند وصولهم إلى السوق (أكثر من 250 ألف دولار أمريكي لكل مريض سنويًا) ، مما يجعل من الصعب توافرها للعديد من المرضى في جميع أنحاء العالم (O ' Sullivan et al.، 2013 Ferkol and Quinton، 2015 Orestein et al.، 2015) ، خاصة لأولئك الذين يعيشون في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل (Cohen-Cymberknoh et al. ، 2016). في البلدان المتقدمة ، كانت بعض السلطات الصحية بطيئة أيضًا في الموافقة على السداد (Bush and Simmonds، 2012 Whiting et al.، 2014 Sharma D. et al.، 2018) ولم يتم حتى الآن التشكيك في فعالية تكلفة هذه العلاجات الدوائية (Gulland، 2016 بالك وآخرون ، 2018). على الرغم من أن تحليل سنة الحياة المعدلة الجودة (QALY) قد لا يعالج بشكل كاف جميع المخاوف المتعلقة بالأمراض النادرة ، مثل التليف الكيسي (Schlander et al. ، 2014 Pearson et al. ، 2018) ، فإن هذه العلاجات تشكل عبئًا كبيرًا على الرعاية الصحية الوطنية الأنظمة ، لأنها باهظة الثمن وطويلة الأمد. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه الأسعار ستستمر بمرور الوقت ، حيث أن العديد من الجزيئات الجديدة تلوح في الأفق وربما تصل إلى السوق خلال السنوات القادمة ، إذا ثبت أنها آمنة وفعالة في الدراسات السريرية. يجب إجراء مزيد من المناقشات بالتأكيد مع ممثلي المرضى ومقدمي الرعاية الصحية وواضعي السياسات والسلطات الحكومية وشركات الأدوية لتحديد الحلول الممكنة والمستدامة التي من شأنها تمكين الوصول العادل إلى المرضى المؤهلين لهذه العلاجات & # x201con-target & # x201d. نأمل أن تؤدي المنافسة في السوق أيضًا إلى خفض أسعار المعدلات مع الموافقة على أسعار جديدة.

على مدى العقود الثلاثة الماضية ، توسع المشهد المستهدف للأمراض البشرية بشكل كبير ، حيث تلقى ما يقرب من 40٪ من المستحضرات الصيدلانية المعتمدة تصنيفًا يتيمًا (أتوود وآخرون ، 2018). قد يكون اكتشاف الدواء وتطويره لجزيء جديد أبطأ بكثير مما كان متوقعًا ، حيث إنها عملية مكلفة مع معدلات استنزاف عالية تعتمد أيضًا على العديد من المتطلبات التنظيمية. أصبحت إعادة استخدام الأدوية (المعروفة أيضًا باسم إعادة تحديد موضع الدواء أو إعادة توصيفه) استراتيجية جذابة بشكل متزايد قد توفر وقتًا ثمينًا وتمويل استثمارات في تطوير الأدوية للأمراض الشائعة والنادرة. نظرًا لأن الأدوية المعتمدة قد خضعت بالفعل لعمليات تقييم سمية مكثفة في كل من الدراسات السريرية التجريبية والمراحل المبكرة ، فقد يتم تقليل الإطار الزمني للحصول على مؤشر مرض جديد ، إذا تم إثبات السلامة والفعالية للاستخدام المعاد توجيهه في الدراسات السريرية في المراحل المتأخرة (Pushpakom وآخرون ، 2019). علاوة على ذلك ، قد تؤدي إعادة استخدام الأدوية إلى الكشف عن علاجات فعالة للمرضى الذين يعانون من الطفرات الشائعة والنادرة المسببة للتليف الكيسي بطريقة سريعة وبتكلفة مجدية لأنظمة الرعاية الصحية الوطنية. في النماذج التجريبية ، تم تصحيح بعض العيوب الأساسية في طفرات CFTR عن طريق إعطاء الأدوية المعتمدة سريريًا ، مثل الجنتاميسين (Howard et al. ، 1996) ، amlexanox (Gonzalez-Hilarion et al. ، 2012) ، escin (Mutyam et al. ، 2016) ، إيبوبروفين (Carlile et al. ، 2015) ، و genistein (Illek and Fischer ، 1998). تشير هذه النتائج إلى أن الأدوية الأخرى الموجودة والمعتمدة لمؤشرات المرض غير ذات الصلة قد يكون لديها القدرة على تصحيح أو التحايل على اختلال وظائف CFTR ويجب استغلالها في بيئة ما قبل السريرية. تمت المطالبة أيضًا بكل من السيستامين والثيموسين & # x3b1-1 لاستعادة التعبير الوظيفي لـ F508del-CFTR (Tosco et al. ، 2016 Romani et al. ، 2017). ومع ذلك ، فشلت عدة مجموعات بحثية مستقلة في التليف الكيسي في إثبات إنقاذ تعبير F508del-CFTR PM ووظيفته عن طريق السيستامين أو الثيموسين & # x3b1-1 (Tomati et al.، 2018b Armirotti et al.، 2019 Awatade et al.، 2019). على الرغم من أن التأثير المناعي لهذه الجزيئات في التليف الكيسي لا يزال بحاجة إلى مزيد من الاستغلال ، إلا أنها لم تثبت تصحيح F508del-CFTR. نظرًا لأن تحديد العلاجات عالية الكفاءة غالبًا ما يجذب انتباه كل من الجماهير العلمية والعلمية ، يجب مراعاة الحذر قبل نشر مثل هذه النتائج في الصحافة لتجنب خلق توقعات مبكرة ، خاصة في مرضى التليف الكيسي وأقاربهم.


تاريخ CF

لقد حدد العاملون الصحيون المرض المعروف الآن باسم التليف الكيسي منذ فترة طويلة كما يتضح من القول المأثور القديم المأخوذ عن الفولكلور الأوروبي الشمالي "ويل لذلك الطفل الذي يكون طعمه مالحًا عند تقبيله على جبهته. إنه مسحور وسرعان ما يموت "(35). حدثت أول مساهمة رئيسية في تحديد سبب التليف الكيسي في عام 1938 عندما قدمت دوروثي أندرسن (بعد إجراء تشريح الجثث للرضع والأطفال المصابين بالمرض ومراجعة تاريخ حالتهم) وصفًا شاملاً لأعراضهم والتغيرات الناتجة عن المرض في مختلف الأعضاء . وأشار أندرسن إلى أنه كان هناك دائمًا تقريبًا تدمير للبنكرياس مصحوبًا بعدوى وتلف المجاري التنفسية في الرئتين. أطلق أندرسن على المرض اسم "التليف الكيسي للبنكرياس". بعد ذلك في عام 1946 ، استنتج الباحثون أن التليف الكيسي موروث وينتج عن طفرة وراثية متنحية. في عام 1948 ، كانت هناك موجة حر مدمرة في مدينة نيويورك وشهدت المستشفيات عددًا غير متناسب من الأطفال المصابين بالتليف الكيسي والذين أصيبوا بالجفاف بسبب فقدان الملح الزائد في عرقهم (26). أدت هذه الملاحظة من قبل P. A. di Sant’Agnese في مستشفى كولومبيا إلى عرضه لنتائجه على الجمعية الأمريكية لطب الأطفال في عام 1953 وتطوير تشخيص حجر الأساس لـ CF ، وهو اختبار كلوريد العرق.


إصلاح التليف الكيسي عن طريق تصحيح مجموعة مجال CFTR

بالنسبة لمرضى التليف الكيسي (CF) ، تركز معظم العلاجات على تخفيف أعراض المرض. ومع ذلك ، فقد تمت دراسة الأساس الخلوي للمرض جيدًا ، حيث يمكن للطفرات في جين التليف الكيسي أن تضعف الطي والإفراز واستقرار سطح الخلية و / أو وظيفة قناة كلوريد CFTR. كان تصحيح هذه العيوب الأساسية تحديًا ، لكنه يشير إلى أن الفهم الأعمق للآلية الجزيئية والخلوية للطفرات هو شرط أساسي لتطوير علاجات أكثر كفاءة.

التليف الكيسي هو مرض وراثي وراثي متنحي مع حدوث 1 في 2500 من القوقازيين ، ويؤثر على 70.000 شخص في أمريكا الشمالية وأوروبا (ريوردان ، 2008). تشمل السمات السريرية قصور البنكرياس ، وعقم الذكور ، والعلوص العقي عند حديثي الولادة ، وعدوى الرئة المزمنة مع الالتهاب المفرط ، مما يؤدي إلى تدهور تدريجي في وظائف الرئة (زيلينسكي ، 2000). يعد فقدان وظائف الرئة السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى التليف الكيسي. تعالج معظم العلاجات الحالية أعراض هذه الجوانب من المرض وزادت متوسط ​​العمر المتوقع للأفراد المصابين بالتليف الكيسي إلى 39 عامًا (أشلوك وأولسون ، 2011).

في عام 1989 ، تم عزل جين CF الذي يشفر منظم توصيل غشاء التليف الكيسي (CFTR) ، وهو عضو في عائلة ناقل ABC (Rommens et al. ، 1989). تم تحديد أكثر من 1900 طفرة في جين التليف الكيسي (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr). يتكون CFTR ، وهو بروتين غشائي متعدد التنظير ، من خمسة مجالات: مجالان لربط النوكليوتيدات (NBDs) ، ومجالان ممتدان للغشاء (MSDs) ومنطقة تنظيمية (R) (ريوردان ، 2008). أظهرت الدراسات البيوكيميائية والبيولوجية الخلوية والوظيفية أن CFTR عبارة عن قناة كلوريد تنظمها ATP والفسفرة (Riordan et al. ، 1989). ينحصر CFTR في غشاء البلازما القمي للظهارة الإفرازية في الشعب الهوائية والأمعاء والبنكرياس والخصية والغدد الخارجية ، بالإضافة إلى الكلوريد ، ينقل البيكربونات وينظم ناقلات الأيونات الأخرى (Gadsby et al. ، 2006).

ما هو الخطأ في CFTRs متحولة؟

تم تصنيف طفرات التليف الكيسي في ست فئات بناءً على مسبباتها الخلوية / الجزيئية (Zielenski ، 2000). تشتمل طفرات الفئة الأولى على طفرات غير منطقية (G542X و R553X) ، مما يؤدي إلى توليد رموز إنهاء مبكرة وطفرات تحول الإطار التي تؤدي إلى بروتين مبتور و / أو غير وظيفي (الشكل 1). تتسبب طفرات الفئة V في سوء الربط أو التداخل مع نشاط المروج. كلا الفئتين يضعفان إنتاج بروتين CFTR وتعبير غشاء البلازما ، مما يتسبب في النمط الظاهري لـ CFTR الشديد.

طفرات الفئة الثانية ، على الرغم من مستويات النسخ العادية ، لديها القليل من CFTR القابل للاكتشاف أو لا يوجد على الإطلاق في غشاء البلازما نتيجة سوء تشكيل البولي ببتيد المترجم حديثًا. تشمل هذه الفئة الطفرة الأكثر شيوعًا ، وهي حذف فينيل ألانين 508 (ΔF508) في NBD1 ، والذي يمكن تحديده في أحد الأليلين أو كليهما في 90٪ من مرضى التليف الكيسي (ريوردان ، 2008). يتم الاحتفاظ بـ F508-CFTR إلى حد كبير في ER ويتحلل بواسطة نظام ubiquitin-proteasome (الشكل 1 Cheng et al. ، 1990 Ward et al. ، 1995).

طفرات الفئة الثالثة (على سبيل المثال ، G551D ، ∼4٪) والفئة الرابعة (على سبيل المثال ، R117H) تضعف دورة فتح قناة CFTR (أو بوابة) والتوصيل ، على التوالي ، دون عيوب مطابقة أو الاتجار. ترتبط طفرات الفئة الثالثة بشكل أساسي بـ NBD1-2 ، في حين يتم ترجمة طفرات الفئة الرابعة إلى مسام القناة (ريوردان ، 2008). تقلل طفرات الفئة السادسة من تعبير CFTR عن طريق تسهيل إزالة القناة من غشاء البلازما. والجدير بالذكر أن بعض الطفرات لها نمط ظاهري مختلط. على سبيل المثال ، تسبب طفرة ΔF508 في الطي ، والبوابة ، وكذلك ضعف استقرار غشاء البلازما (Dalemans et al. ، 1991 Denning et al. ، 1992 Lukacs et al. ، 1993).

تصحيح العيوب الأساسية

نظرًا لأن التليف الكيسي هو مرض أحادي الجين ، فمن المفترض أن يتم تخفيف النمط الظاهري السريري عن طريق تصحيح العيوب الأساسية التي تسببها الطفرات المختلفة التي تعيق أو تمنع وظيفة CFTR أو التعبير أو كليهما (Cai et al. ، 2011). تركزت الجهود المبذولة لتصحيح العيوب الأساسية للتكوين الحيوي CFTR والوظيفة بشكل أساسي على الطفرات الأكثر انتشارًا: ΔF508 و G551D وكودونات الإنهاء المبكر (الشكل 1).

قراءة أكواد الإنهاء المبكر.

تتفاعل الأمينوغليكوزيدات مثل الجنتامايسين مع الرنا الريباسي حقيقيات النواة داخل الوحدات الفرعية الريبوزومية وتقلل من دقة الترجمة عن طريق مقاطعة وظيفة التدقيق اللغوي العادية (Burke and Mogg ، 1985). وبالتالي ، تسمح aminoglycosides بإدخال حمض أميني قريب في كودون إنهاء مبكر وترجمة منطقة التشفير بأكملها. تم استخدام الأمينوغليكوزيدات لقمع أكواد الإنهاء المبكر ، مما أدى إلى تخليق CFTR كامل الطول في مرضى التليف الكيسي مع طفرات من الفئة الأولى (Wilschanski et al. ، 2003). تم تطوير Ataluren (PTC124) ، وهو دواء متوفر بيولوجيًا عن طريق الفم مع سمية متناقصة ، بواسطة اختبار فحص عالي الإنتاجية يعتمد على الخلية (Welch et al. ، 2007). على الرغم من أن Ataluren يقمع بشكل انتقائي كودون الإنهاء المبكر في نموذج الفأر (Welch et al. ، 2007) ، إلا أنه أظهر كفاءة متغيرة بين المرضى الذين لديهم أنماط وراثية مختلفة (Rowe et al. ، 2007). تم الإبلاغ عن Ataluren الذي يتم تناوله عن طريق الفم لإنقاذ نشاط CFTR مع أكواد الإنهاء المبكر في تجارب المرحلة الثانية (Kerem et al. ، 2008 Sermet-Gaudelus et al. ، 2010). تجري حاليًا دراسة سريرية للمرحلة الثالثة لتقييم الفعالية والسلامة على المدى الطويل (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00803205).

هل يمكن تصحيح عيوب ΔF508-CFTR القابلة للطي والمعالجة والوظيفية؟

من حيث المبدأ ، يمكن إبطال عيب الطي CFTR عن طريق المرافقين الدوائيين (أجهزة الكمبيوتر) ، على غرار أمراض سوء القولبة الأخرى ، حيث يمكن لمجموعة متنوعة من الروابط أو الركائز أن تثبت التشكل الوظيفي للبروتين المستهدف (بيرنييه وآخرون ، 2004). على الرغم من أن هذا النهج سيكون محددًا للغاية ، ويحافظ على التنظيم الداخلي ونمط التعبير لـ CFTR ، إلا أن روابط CFTR عالية التقارب غير متوفرة. يمكن أيضًا استغلال تغيير بيئة الطي الخلوي للتغلب على سوء التشكيل الطافر / المعالجة الخاطئة وقد أظهر بعض النجاح في الإعدادات قبل السريرية (Balch et al. ، 2011). يمكن للمرافقين الكيميائيين المشابهين لدرجة الحرارة المنخفضة أيضًا مواجهة اختلال F508-CFTR وإحداث تراكم متواضع للقنوات الوظيفية جزئيًا ولكن غير المستقرة في غشاء البلازما (Denning et al. ، 1992 Sato et al. ، 1996 Sharma et al. ، 2001).

دفع الكشف عن إمكانية إنقاذ ΔF508-CFTR إلى تطوير مقايسة فحص عالية الإنتاجية تعتمد على الخلايا باستخدام مؤشر هاليد أصفر مبني على أساس البروتين الفلوري ، والذي يراقب نفاذية كلوريد غشاء البلازما المُنشّط بـ cAMP ، بما في ذلك نشاط CFTR ، عن طريق الاستشعار التغيرات في تركيز هاليد السيتوبلازم (Galietta et al. ، 2001). أصبح هذا الاختبار مفيدًا في تحديد ليس فقط "المصححات" التي تحسن التعبير عن غشاء البلازما ΔF508-CFTR ، ولكن أيضًا "المحفزات" لتنشيط قنوات CFTR المقيمة في غشاء البلازما. ومن المثير للاهتمام ، أن الفحص حدد أيضًا مثبطات قنوات الكلوريد ، والتي قد تكون علاجات محتملة في الإسهال الإفرازي (Verkman and Galietta ، 2009).

أنتج فحص المكتبات الكيميائية المتنوعة عدة فئات من مصححات ΔF508-CFTR ذات الجزيئات الصغيرة ، بما في ذلك corr-4a ونظائرها (Pedemonte et al. ، 2005a). تم الحصول على مصححات إضافية أيضًا من خلال طرق الفرز والحساب عالية الإنتاجية (Kalid et al. ، 2010 Robert et al. ، 2010 Sampson et al. ، 2011). ومع ذلك ، فإن فعالية هذه المصححات في استعادة توصيل الكلوريد كانت محدودة ووصلت فقط إلى 10٪ من الظهارة الأولية البشرية الطبيعية ، وهي أقل بكثير من المتطلبات المتوقعة للكفاءة العلاجية (Pedemonte et al.، 2005a، 2010 Van Goor et al.، 2006). نهج مماثل من قبل Vertex Pharmaceuticals ، Inc. مع دعم Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT) أسفر عن فئات جديدة من المصححات ، بما في ذلك VX-809 ، المركب الواعد الذي يتم تقييمه في المرحلة الثالثة من التجارب السريرية (Van Goor et al. ، 2006 ، 2011). يستعيد VX-809 نشاط قناة CFTR بنسبة 15 ٪ في ظهارة الجهاز التنفسي الأولية التي تعبر عن ΔF508-CFTR ، ولكن يبدو أن لها فوائد سريرية هامشية (Van Goor et al. ، 2011 Clancy et al. ، 2012).

إعادة تنشيط قنوات غشاء البلازما المعيبة CFTR.

كما قامت فحوصات الفرز الوظيفية عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلية بعزل العديد من المحفزات التي تعمل على تحسين وظيفة القناة لطفرات الصنفين الثاني والثالث (Pedemonte et al. ، 2005b Van Goor et al. ، 2006). أكثر المحفزات الواعدة ، VX-770 (Ivacaftor) ، المعزول بواسطة Vertex Pharmaceuticals ، Inc. ، يعيد نشاط G551D-CFTR إلى ∼50 ٪ من مستوى النوع البري (Van Goor et al. ، 2009). أكدت الدراسات السريرية السلامة على المدى القصير والفوائد السريرية ، بما في ذلك انخفاض معدل تفاقم الرئة بنسبة 55٪ وزيادة وظائف الرئة بنسبة 10٪ (Ramsey et al.، 2011). Ivacaftor هو أول دواء معتمد من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لعلاج مرضى G551D-CFTR (∼4 ٪ من سكان التليف الكيسي) ، وهو ما يمثل إنجازًا ترجميًا بارزًا ، ويستغل البيولوجيا الأساسية لـ CFTR وسنوات من البحث والتطوير في كل من الأوساط الأكاديمية والصناعية.بشكل ملحوظ ، يعيد Ivacaftor أيضًا عيب البوابات للعديد من طفرات الفئة الثانية الأخرى ، وبالتالي ، قد يفيد ∼10 ٪ من مرضى التليف الكيسي (Yu et al. ، 2012).

يمكن أن يكون العلاج المركب من المحفزات والمصححات مفيدًا لتحسين وظيفة ΔF508-CFTR نظرًا للعيب المستمر في بوابة ΔF508-CFTR الذي تم إنقاذه عند غشاء البلازما. في الواقع ، تشير النتائج المؤقتة لتجربة إكلينيكية من المرحلة الثانية إلى أن مرضى ΔF508 CF الذين عولجوا بمزيج من VX-809 و Ivacaftor يبدو أنهم يظهرون وظائف رئوية أفضل من أولئك الذين عولجوا بأي عقار بمفرده (http://clinicaltrials.gov/ct2/show / NCT01225211).

التحديات المقبلة: العلاج الفعال لـ ΔF508-CFTR

على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث CFTR ، فإن المزيد من التحسين في التعبير الوظيفي لـ ΔF508-CFTR ، وهو الطفرة الأكثر شيوعًا في مرضى التليف الكيسي ، ضروري لأن تصحيح النمط الظاهري للتليف الكيسي يتطلب على الأرجح استعادة 35 ٪ من نشاط غشاء البلازما CFTR من النوع البري. يجب أن يساعد توضيح طي / سوء تشكيل CFTR وآليات التصحيح المتاحة في تحقيق هذا الهدف. هنا ، نركز على الجهود المبذولة لفهم وتصحيح عيوب الطي في ΔF508-CFTR.

طي المجال CFTR وإخفاقه.

يدعم الدليل المقنع نموذج طي المجال المقترن لـ CFTR. وفقًا لذلك ، يمكن للمجالات الفردية أن تطوى عبر الترجمة إلى الحالات غير المستقرة ولكن تحقيق الطية الأصلية لـ CFTR يتطلب تجميع مجال ما بعد الترجمة وتفاعلات بين المجالات التي تعتبر حاسمة في الطي المناسب (الشكل 2 أ دو وآخرون ، 2005 هي وآخرون ، 2008 ، 2010 Du and Lukacs، 2009). يساعد المرافقات (Rosser et al. ، 2008) على النضج المطابق البطيء لما بعد الترجمة وينعكس من خلال التكوين المتأخر لواجهات NBD-MSD في النوع البري الناضج CFTR (He et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008) ). يساهم عدم الاستقرار النشط للمجالات الفردية وتجميع المجال البطيء مع حركيات التحلل السريع المرتبطة بـ ER للوسائط القابلة للطي في الطي غير الفعال (∼30 ٪) من CFTR من النوع البري (الشكل 2 ب) ويتم توعية أكثر بالنقطة الطفرات في التليف الكيسي (رابح وآخرون ، 2012).

كيف تؤثر طفرة ΔF508 على القناة؟ كشفت تجارب النمذجة المتماثلة والربط المتبادل للسيستين عن البنية الفريدة ثلاثية الأبعاد لـ CFTR والدور المحتمل لـ F508 (He et al. ، 2008 Mornon et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008). في CFTR الأصلي ، تشكل بقايا F508 والمنطقة المحيطة في NBD1 واجهة مع حلزون اقتران الحلقات السيتوبلازمية 4 (CL4) و 1 (CL1) في MSD2 و MSD1 ، على التوالي ، مما يخلق رقعة كارهة للماء. يرتبط NBD2 بـ CL2 و CL3 لـ MSD1 و MSD2 ، على التوالي. تنقل هذه الواجهات التغييرات المطابقة لـ NBDs إلى MSDs أثناء بوابة القناة ، وهي ضرورية لطي CFTR (Wang et al. ، 2007 He et al. ، 2008 ، 2010 Mornon et al. ، 2008 Serohijos et al. ، 2008 Loo et al.، 2010 Thibodeau et al.، 2010 Grove et al.، 2011). يؤدي زعزعة استقرار الواجهة عن طريق الطفرات الخاطئة في CLs أو عن طريق الطفرات في السلسلة الجانبية F508 إلى تعطيل الطي (Du et al.، 2005 Mornon et al.، 2008 He et al.، 2010 Loo et al.، 2010 Thibodeau et al.، 2010). تدعم هذه الملاحظات النموذج الناشئ للنضج المطابق لما بعد الترجمة لـ CFTR الذي يتضمن استقرار المجال النشط و / أو الحركي أثناء طي المجال المقترن (Du and Lukacs ، 2009) ، على غرار نموذج متعدد قابل للذوبان. بروتينات المجال وناقل BtuCD (الشكل 2 A Han et al. ، 2007 DiBartolo and Booth ، 2011).

استهداف أكثر من عيب واحد قابل للطي في ΔF508-CFTR.

كشفت الدراسات الحديثة أن ΔF508-NBD1 غير مستقر ديناميكيًا وحركيًا عند درجة الحرارة الفسيولوجية ، واقترحت أن استقرار NBD1 من شأنه أن يصد بشكل فعال معالجة ΔF508-CFTR الخاطئة (Protasevich et al. ، 2010 Wang et al. ، 2010). والمثير للدهشة أن الأمر لم يكن كذلك. حتى الاستقرار التوافقي الكبير لـ ΔF508-NBD1 بواسطة طفرات الموقع الثاني أدى إلى إنقاذ متواضع (& lt20٪) من معالجة ΔF508-CFTR ، وتعبير غشاء البلازما ، والوظيفة ، وفشل في إعادة طي المجال المقترن (الشكل 2 ب ميندوزا وآخرون ، 2012 رابح وآخرون ، 2012). وبالمثل ، فإن عكس عدم استقرار واجهة NBD1 – MSD2 عن طريق طفرات الموقع الثاني (على سبيل المثال ، R1070W) أنقذ بشكل هامشي النمط الظاهري ΔF508-CFTR (الشكل 2 ب). بشكل ملحوظ ، أدى التثبيت الجيني المتزامن لطاقة NBD1 والواجهة NBD1-MSD2 إلى إنقاذ قوي وتآزري (65-80 ٪) من طي ΔF508-CFTR ووظيفته (الشكل 2 ب رابح وآخرون ، 2012). تم التوصل إلى استنتاج مماثل من خلال تحليل التسلسلات المتطورة المقترنة ببقايا F508 (Mendoza et al. ، 2012). تشير هذه النتائج غير المتوقعة إلى أن تصحيح عيبين بنيويين أساسيين ضروري وكاف لاستعادة وظيفة CFTR في معظم مرضى التليف الكيسي.

الآثار المترجمة لآلية اختلال التشكيل ΔF508-CFTR

أبرز اكتشاف عيبين أساسيين في الطي في ΔF508-CFTR ثلاثة آثار دوائية (الشكل 2 ج): (1) توفر عيوب الطي الجمع تفسيراً معقولاً للفعالية المتواضعة للمصححات الفردية التي قد تستهدف واحدًا منهم فقط مع وجود حاليًا. آلية (آليات) غير معروفة (Sampson et al. ، 2011 Van Goor et al. ، 2011) (2) يمكن لطفرات الموقع الثانية التي تتصدى لأحد عيوب الطي الأولية أن تعزز التصنيف الميكانيكي لجزيئات المصحح الحالية ، فضلاً عن تحديد الجزيئات الجديدة من خلال الجيل الثاني من فحوصات الفرز عالية الإنتاجية المستهدفة للعيوب الهيكلية (3) من المحتمل أن يكون التصحيح لكل من NBD1 النشط والواجهة مطلوبًا لتطبيع معالجة ΔF508-CFTR والتعبير والوظيفة (الشكل 2 ج). ما إذا كان يمكن تحقيق ذلك عن طريق واحد أو اثنين من الجزيئات الصغيرة وحدها ، أو بالاشتراك مع منظمات شبكة البروتيوستاس التي تعدل بشكل غير مباشر طي ΔF508-CFTR ، والاتجار ، والوظيفة (Balch et al. ، 2011) في انتظار مزيد من التجارب.

التحديات الرئيسية الأخرى للترجمة

في هذا البحث ، وصفنا العواقب الخلوية لطفرات CFTR والجهود الأخيرة لفهم عيوب الطي الكامنة وراء طفرة ΔF508-CFTR من أجل تحسين طي القناة واستقرارها ووظيفتها. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من القضايا الحاسمة. إن فهمنا للكيفية التي يؤدي بها فقدان وظيفة القناة إلى التليف الكيسي ، وخاصة أعراض الرئة ، غير مكتمل (Ashlock and Olson ، 2011) ويتفاقم بسبب حقيقة أن نماذج الفئران تفشل في تلخيص مرض الرئة التليف الكيسي ، على الرغم من تطور الخنازير المعدلة وراثيًا و قد تعالج نمس هذه المشكلة (روجرز وآخرون ، 2008 صن وآخرون ، 2010). يتم إعاقة الدراسات الميكانيكية للقناة بسبب انخفاض عدد النسخ وعدم استقرار المسوخ والصعوبات في مراقبة التغيير الهيكلي والتفاعل بين البروتين والبروتين والاتجار بدقة مكانية زمانية عالية في البيئة الخلوية المناسبة (Riordan، 2008 Balch et al.، 2011). بالإضافة إلى برامج اكتشاف الأدوية الموضحة في هذه الورقة ، هناك جهود مستمرة لاستبدال الطفرة بالعلاج الجيني و / أو تنشيط إفراز الكلوريد البديل. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية المتعددة تعيق التوصيل النووي للجين المحور CFTR المعبأ إما في مجمعات دهنية كاتيونية أو فيروسات ، على الرغم من أن التغلب على هذه العمليات قد يسمح بعلاج مستقل عن النمط الجيني (Griesenbach and Alton ، 2009). فتح تحديد الشكل الإسوي الظهاري لقناة الكلوريد المنشط Ca 2+ (TMEM16A) إمكانية التنشيط الدوائي لمسار إفراز كلوريد بديل (Ferrera et al. ، 2010).

يعتمد النجاح النهائي للبحث المترجم غالبًا على فهمنا التفصيلي للمشكلة البيولوجية الأساسية المطروحة. نأمل أن يساعد هذا المنظور القصير في إلهام المزيد من الأبحاث البيولوجية ، وهو شرط أساسي للنجاحات الانتقالية في علاج العيوب الأساسية في التليف الكيسي والأمراض الوراثية الأخرى مثل السكري الكاذب وفرط كوليسترول الدم العائلي.


الانتماءات

خدمات البحوث السريرية ، معهد الأبحاث ، مستشفى الأطفال المرضى ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا

مدرسة دالا لانا للصحة العامة ، جامعة تورنتو ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا

Annie Dupuis PhD، Lisa J. Strug PhD، ScM & amp Tanja Gonska MD

برنامج في علم وظائف الأعضاء والطب التجريبي ، معهد البحوث ، مستشفى الأطفال المرضى ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا

تخصص طب الأطفال ، كلية صحة المرأة والطفل ، كلية الطب ، جامعة نيو ساوث ويلز ، سيدني ، أستراليا

قسم أمراض الجهاز الهضمي ، مستشفى سيدني للأطفال راندويك ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا

شركة GeneYouIn Inc. ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا

قسم علم الأوبئة ، كلية كولورادو للصحة العامة ، جامعة كولورادو دنفر ، حرم أنشوتز الطبي ، أورورا ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم طب الأطفال ، جوستوس ليبيج ، جيسن ، جيسن ، ألمانيا

مركز التليف الكيسي ، Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata ، فيرونا ، إيطاليا

مستشفى الأطفال المرضى وقسم الإحصاء الحيوي ، برنامج علم الوراثة وبيولوجيا الجينوم ، معهد الأبحاث

ليزا جيه ستروغ دكتوراه ، ScM & amp Johanna M.

قسم الوراثة الجزيئية ، جامعة تورنتو ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا

قسم طب الأطفال ، جامعة تورنتو ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا


شاهد الفيديو: الأمراض التنفسية 15 التليف الكيسي. دافيدسون بالعربي. Cystic Fibrosis (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Vallen

    انها الشرطية

  2. Nasir Al Din

    أهنئ ، ما هي الكلمات ... ، الفكرة الرائعة

  3. Lawrence

    لم أقل ذلك.

  4. Trevion

    أنا في النهاية ، أعتذر ، هناك اقتراح بأنه يجب علينا أن نأخذ طريقًا مختلفًا.

  5. Wichell

    حق تماما! الفكرة رائعة ، أنا أؤيدها.



اكتب رسالة