معلومة

15: لائحة الجينات 1 - مجموعات التعبير الجيني - علم الأحياء

15: لائحة الجينات 1 - مجموعات التعبير الجيني - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

15: لائحة الجينات 1 - تجميع التعبير الجيني

ScPADGRN: نهج ADMM مشروط مسبقًا لإعادة بناء شبكة تنظيم الجينات الديناميكية باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

يتضمن تطوير المرض وتمايز الخلايا على حد سواء تغييرات ديناميكية ، وبالتالي فإن إعادة بناء شبكات تنظيم الجينات الديناميكية (DGRNs) هي مشكلة مهمة ولكنها صعبة في بيولوجيا الأنظمة. مع التطورات التقنية الحديثة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) ، يتم الحصول على كميات كبيرة من بيانات scRNA-seq لعمليات مختلفة. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق الحالية لاستنتاج DGRNs من العينات السائبة قد لا تكون مناسبة لبيانات scRNA-seq. في هذا العمل ، نقدم scPADGRN ، وهي طريقة استدلال جديدة لـ DGRN باستخدام بيانات "سلسلة زمنية" scRNA-seq. يجمع scPADGRN بين طريقة الاتجاه المتناوب المشروطة مسبقًا للمضاعفات مع تجميع الخلايا لإعادة بناء DGRN. يتميز بالدقة والمتانة والتقارب السريع. علاوة على ذلك ، يتم تقديم مؤشر كمي يسمى إثراء تفاعل جينات التمايز (DGIE) لتحديد الإثراء التفاعلي للجينات المتعلقة بالتمايز. من نتائج DGIE للشبكات الفرعية ذات الصلة ، نستنتج أن وظائف الخلايا الجذعية الجنينية (ES) تكون أكثر نشاطًا في البداية وقد تتلاشى تدريجياً بمرور الوقت. تزداد قوة الاتصال للجينات المساهمة المعروفة التي تسهل تمايز الخلايا من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا المتمايزة نهائيًا. نحدد أيضًا العديد من الجينات المسؤولة عن التغييرات في درجات DGIE التي تحدث أثناء تمايز الخلايا بناءً على ثلاث مجموعات بيانات حقيقية أحادية الخلية. توضح نتائجنا أن تحليلات الخلية الواحدة المستندة إلى الاستدلال الشبكي المقترن بالحسابات الكمية يمكن أن تكشف عن منظمات النسخ الرئيسية المشاركة في تمايز الخلايا وتطور المرض.


مقدمة

هناك أنواع مختلفة من العمليات في الخلية تعمل معًا لأداء أنشطة مختلفة. اعتمادًا على المكونات وأنواع تفاعلها ، بشكل عام ، لدينا ثلاثة أنواع من الشبكات البيوكيميائية على المستوى الخلوي الفرعي: شبكات التمثيل الغذائي ، وشبكات تحويل الإشارات ، وشبكات تنظيم الجينات. شبكة تنظيم الجينات (GRN) هي شبكة من التفاعلات الجينية الجينية التي تحكم تعبيرها. يعد تنظيم التعبير الجيني أمرًا مهمًا لأنه ينظم كمية إنتاج البروتين في الخلية.

يعتبر استدلال شبكات تنظيم الجينات أحد المشاكل الرئيسية في بيولوجيا الأنظمة [1 ، 2]. كان هناك نمو هائل في أساليب الهندسة العكسية لإعادة بناء الشبكة على مدى العقدين الماضيين [3-7]. على الرغم من أنه منذ العقد الماضي ، جعلت التقنيات عالية الإنتاجية مثل المصفوفات الدقيقة و RNA-seq إتاحة بيانات التعبير الجيني ، لا يزال الاستدلال الشبكي يمثل مشكلة صعبة نظرًا لعوامل مثل العشوائية ، وضوضاء القياس ، وقيم التعبير المفقودة ، والوقت المحدود نقاط ، الخ في بيانات التعبير [8]. بصرف النظر عن هذه القيود ، فإن الضوضاء الناتجة عن التقنيات عالية الإنتاجية مثل المصفوفات الدقيقة للحمض النووي حيث تحتوي البيانات على نسبة ضوضاء عالية إلى الإشارة تخلق أيضًا عقبة في استدلال الشبكة وغالبًا ما يتم تجاهلها أثناء تطوير أساليب الهندسة العكسية [9].

تم استخدام طرق مختلفة مؤخرًا لاستدلال الشبكة من بيانات السلاسل الزمنية مثل نماذج ODE [10] ، وشبكات Bayesian [11] ، والنماذج الرسومية Gaussian [12] ، والشبكات العصبية [13] ، وطرق نظرية المعلومات [14]. تم تقديم المراجعات الحديثة لطرق الاستدلال بشبكة تنظيم الجينات وقيودها في [15 ، 16]. Huynh-Thu et al. [15] قدم استعراضًا تمهيديًا للمجال من خلال تقديم خلفية المفاهيم البيولوجية الأساسية المعنية أولاً ، ثم تقديم مناهج استدلال مختلفة بطريقة مصنفة. توفر الورقة أيضًا روابط لأدوات البرامج المتاحة للجمهور لاستدلال الشبكة. بانف وآخرون. [16] عرضت مراجعة لطرق استدلال GRN ، وحدودها ، وتطبيقها على الأنواع النباتية أ. ثاليانا. تركز الورقة أيضًا على أنواع البيانات المختلفة التي يمكن استخدامها لاستدلال GRN مثل معلومات موقع ربط عامل النسخ ، وبيانات رسم خرائط التشكل الكروماتين ، والحاجة إلى دمج مجموعات البيانات المختلفة للحصول على نتائج أكثر ملاءمة.

يمكن قياس بيانات التعبير في حالة ثابتة أو إنشاؤها كسلسلة زمنية. بشكل عام ، في إنشاء بيانات السلاسل الزمنية ، تكون الحالة المستقرة للشبكة مضطربة ، ويتم تسجيل قيم التعبير المتطورة حتى تصل الشبكة إلى الحالة المستقرة مرة أخرى. نظرًا لأن مجموعات بيانات السلاسل الزمنية لها قيم تعبير متطورة للجينات المسجلة في لحظات زمنية مختلفة ، فإنها تعتبر أكثر إفادة حول ديناميكيات الشبكة الأساسية من بيانات الحالة الثابتة. يمكن استنتاج العلاقات السببية بين الجينات من بيانات السلاسل الزمنية فقط. لقد ثبت أن نهج الاستدلال GENIE3 (الذي يعتمد على بيانات الحالة المستقرة) ، يعمل بشكل ضعيف على بيانات السلاسل الزمنية [17]. وبالتالي ، فإنه يشير إلى أن النهج المتبع في عملية الاستدلال يجب أن يستفيد من المعلومات الخاصة بنقاط زمنية متعددة لالتقاط التفاعلات بين الجينات بشكل أفضل.

في شبكات تنظيم الجينات [18 ، 19] ، تتفاعل الجينات مع بعضها البعض لأداء وظائف خلوية محددة. التفاعلات الجينية هي تفاعلات تنظيمية بين الجين المنظم (المعروف أيضًا باسم عامل النسخ (TF)) والجين المستهدف. يتم التعبير عن الجين المستهدف اعتمادًا على نشاط تنظيم الجينات. يمكن أن يكون التفاعل بين الجين المنظم للجين المستهدف إما منشطًا أو مثبطًا. يؤدي تنشيط التنظيم إلى تسريع إنتاج الجين المستهدف (ويتم التعبير عن الجين المستهدف) بينما يؤدي في تثبيط التنظيم إلى إبطاء إنتاج الجين المستهدف حتى أقل مما تم إنتاجه (معبرًا عنه) في غياب هذا الجين المنظم المثبط. بشكل عام ، هناك بعض ثابت التوليف المرتبط بإنتاج كل جين مستهدف. نتيجة لذلك ، يمكن التعبير عن الجين (وإن كان بمستوى منخفض جدًا) حتى في غياب أي جين منظم [7 ، 20]. وبالمثل ، هناك بعض ثابت الاضمحلال المرتبط بكل جين. ومع ذلك ، فإن تدهور الجينات هو عملية أبطأ من تخليق الجينات. وهكذا ، في ظل وجود تنظيم مثبط ، يمكن اعتبار النتيجة الصافية على أنها نتيجة تدهور الجين المستهدف [7 ، 20].

بيانات التعبير الجيني هي على شكل مستويات التعبير الجيني المستمر. في تنظيم الجينات ، يبقى الجين المنظم في شكله غير النشط حتى يصل إلى تركيز عتبة. فقط عندما يزيد تركيزه فوق عتبة التركيز ، يصبح نشطًا [21]. يمكن تفسير الشكل السيني للتفاعل الحقيقي في تنظيم الجينات كدالة خطوة في تجريدها المنطقي [22]. لذلك ، يمكن تفسير الآلية التنظيمية للجينات في شكل التبديل ، أي ON أو OFF. في وجهة نظر التجريد المنطقي ، يرتبط الجين المنظم (أو TF) في حالته ON بالحمض النووي ويبدأ في تنظيم الجين المستهدف. وبالتالي ، ينتقل الجين المستهدف عند إنتاجه من حالة OFF إلى حالة ON. يساعد تحديد بيانات السلاسل الزمنية في تحديد الجينات المنظمة المحتملة للجين المستهدف.

حاول الباحثون استكشاف سلوك شبكات GRN باستخدام بيانات منفصلة. إيتو وآخرون. [23] تحليل نوعي لسلوك GRN باستخدام التجريد المنطقي لمستويات التعبير الجيني باستخدام حالتين ON و OFF واستغلال التبديل بين حالتين لالتقاط سلوك GRN. شواب وآخرون. [24] استخدم العديد من المستويات المنفصلة لتمثيل حالة الجينات ونمذجة بعض جوانب الأنظمة البيولوجية مثل التنظيم الذاتي السلبي. وهكذا ، فإن التجريد المنطقي لقيم التعبير الجيني المستمر يحافظ على السمات النوعية لديناميكيات النظام مثل السلوك التذبذب ، والحالة المستقرة ، وإمكانية الوصول [22]. كوفنر وآخرون. [25] اقترح نموذج شبكة بيتري بمنطق ضبابي (PNFL) لاستدلال GRN. PNFL هو نهج منفصل قائم على القواعد يقوم بإجراء عمليات محاكاة لاسترداد ديناميكيات النظام جنبًا إلى جنب مع طوبولوجيا.

في هذه الورقة ، سوف نقدم نهجًا منفصلاً قائمًا على النظام لاستدلال شبكات GRN أثناء التعامل مع قضايا الضوضاء ، والستوكاستك. يعني النهج القائم على النظام المنفصل أن النهج يعتمد على نظام منفصل حيث يوجد عدد قابل للعد من مستويات التعبير الجيني في البيانات.


نتائج

تسلسل الجينوم والتجميع والتوصيف

جينوم البطلينوس الصلب م. المرتزقة تم تسلسلها بقراءات Illumina ، و PacBio Single Molecule Real-Time (SMRT) ، و 10x الجينوم ، وتسلسل Hi-C (ملف إضافي 2: الجدول S1) ، مما أدى إلى تجميع مرجعي يبلغ 1.79 جيجا بايت مع contig N50 = 1.77 ميجا بايت (إضافي ملف 2: الجدول S2). حجم م. المرتزقة تم تقدير الجينوم بـ 1.78 جيجابايت (مع تغاير الزيجوت بنسبة 1.34 ٪) بناءً على كتحليل -mer (ملف إضافي 2: الجدول S3) ، وهو قريب من حجم الجينوم المقدر عبر قياس التدفق الخلوي [30]. تم استخدام تسلسل Hi-C لوضع وتوجيه 1541 سقالة تمتد على 1.74 جيجابايت (سقالة N50 = 91.38 ميجا بايت) إلى 19 كروموسومًا متجاورًا ، بما يتوافق مع العدد أحادي العدد (الشكل 1 أ ، ملف إضافي 4: الشكل S2 وملف إضافي 2: الجدول 4 س). كان التجميع على مستوى الكروموسوم عالي الجودة والجودة حيث يمكن تعيين أكثر من 95 ٪ من قراءات الإدخال القصير من Illumina بنجاح إلى التجميع (ملف إضافي 2: الجدول S5). أظهر تقييم BUSCO اكتمال 90.5 ٪ من الجينات الأساسية المحفوظة (ملف إضافي 2: الجدول S6) ، والتي يمكن مقارنتها أو أقل قليلاً (ربما بسبب الجينوم الكبير للبطلينوس الصلب ، وتعدد الأشكال العالي ، واستخدام فرد غير فطري) من تلك الموجودة في جينومات ذات الصدفتين المنشورة.

توصيف وتحليل النشوء والتطور لجينوم البطلينوس الصلب. أ المشهد الجينومي للبطلينوس الصلب. من الدوائر الخارجية إلى الداخلية: أ ، 19 كروموسومًا بمقياس ميغابايت ب ، رقم جين IAP على كل كروموسوم ج ، توزيع كروموسومي لـ 159 IAPs ، مع خطوط خارجية وداخلية تشير إلى خيوط الإحساس ومضاد المعنى ، على التوالي. تمثل كل واصلة على هامش الدائرة نسخة جينية IAP د

h ، كثافة ترانسبوزونات الحمض النووي ، كثافة TE ، كثافة التكرار ، كثافة الجينات ، وكثافة GC عبر الجينوم ، على التوالي ، مرسومة في نوافذ غير متداخلة 1 ميجا بايت. ب شجرة النشوء والتطور معايرة الزمن للبطلينوس الصلب داخل metazoans. تشير الأرقام الموجودة على الفروع إلى عدد الجينات المكتسبة (+ ، الأخضر) والمفقودة (- ، الأحمر). Pfu ، بينكتادا فوكاتا Cvi ، كراسوستريا فيرجينيكا ميلا في الساعة ، موديولوس فيليبيناروم افا ، Azumapecten farreri سيدتي ، Mercenaria mercenaria Rph ، Ruditapes philippinarum CSQ ، أقحوان الكريسومالون Lgi ، لوتيا جيجانتيا Bgl ، Biomphalaria glabrata أكا ، أبليسيا كاليفورنيكا Adu ، Architeuthis dux أوبي ، الأخطبوط bimaculoides Cte ، كابيتيلا تيليتا حرو ، هلوبديلا روبوستا آمي ، أبيس ميليفيرا ديمي ، ذبابة الفاكهة سوداء البطن هسا ، الانسان العاقل Bfl ، ورم برانكيوستوما فلوريدي Branchiostoma floridae نفي ، Nematostella vectensis. ج تم توسعة أفضل 10 مسارات وأكبر ثلاثة مسارات متعاقد عليها تم إثرائها في المحار الصلب

حددت التعليقات التوضيحية باستخدام EVidenceModeler التي تجمع بين التنبؤ المبدئي والتماثل مع الأنواع الأخرى وبيانات RNA-seq 34283 جينًا [31 ، 32] (ملف إضافي 2: الجدول S7). مجموعة جينات المحار الصلب أكبر قليلاً من معظم ذوات الصدفتين التي تم تسلسلها حتى الآن ، ولكنها تشبه تلك الموجودة في المحار الشرقي كراسوستريا فيرجينيكا (34596) وأصغر من بلح البحر موديولوس فيليبيناروم (36،549). بشكل عام ، تشفر جينومات ذات الصدفتين المزيد من الجينات وتظهر تعدد أشكال أعلى من الجينوم البشري (ملف إضافي 2: الجدول S8). تمثل العناصر القابلة للتحويل (TEs) 49.11٪ من الجينوم مع ترانسبوزون DNA (34.24٪) ، التكرارات الطرفية الطويلة (LTRs ، 10.04٪) ، والعناصر المتناثرة الطويلة (LINEs ، 7.17٪) التي تشتمل على فئات الينقولات الرئيسية الثلاثة (ملف إضافي 2) : الجدول S9).

توسيع المجالات المتعلقة بالاستماتة وشبكة التعبير المشترك

لتحديد موضع النشوء والتطور للبطلينوس الصلب ، تم اختيار تسعة عشر جينومًا ميتازوانًا (الشكل 1 ب) من Cnidaria و Annelida و Mollusca و Arthropoda و Chordata و Vertebrata لتجميع عائلة الجينات ، والتي حددت 43245 عائلة جينية بما في ذلك 237 عائلة جينية ذات نسخة واحدة . تم استخدام الجينات أحادية النسخة من جينومات ميتازوان التسعة عشر لتحليل النشوء والتطور بأسلوب احتمالية قصوى. قمنا بتأريخ وقت تباعد البطلينوس الصلب من أقرب عقدة له (Ruditapes philippinarum) إلى ما يقرب من 178.9 ميا (الشكل 1 ب). من سلف Heteroconchia المشترك إلى م. المرتزقة، توسعت 229 عائلة جينية مع إثراء كبير في الجينات المتعلقة بالاستجابة المناعية ومسارات موت الخلايا المبرمج مثل إشارات مستقبلات NOD ، وتحلل البروتين بوساطة يوبيكويتين ، وإشارات TNF-kappa B (الشكل 1 ج ، ملف إضافي 3: الجدول S10). يشير توسع عائلات الجينات المناعية والمتعلقة بالاستماتة إلى أن هذه العائلات الجينية مهمة لتكييف البطلينوس الصلب.

نظرًا لأن موت الخلايا المبرمج هو أحد المسارات الأكثر توسعًا بشكل ملحوظ في م. المرتزقة، ركزنا مزيدًا من التحليل على مسار موت الخلايا المبرمج بما في ذلك مسارات الإشارات التنظيمية مثل إشارات مستقبلات تشبه NOD ومسارات إشارات TNF-kappa B. بحثنا في المجالات المتعلقة بالاستماتة في جينوم م. المرتزقة وقارنوا نتائجنا مع تلك التي تم الحصول عليها للأنواع الأخرى (الشكل 2) ، لتوصيف توسع الجينات المرتبطة بالاستماتة. تم توسيع سبعة مجالات أساسية تتعلق بالاستماتة ، BIR ، TNF ، DEATH ، CARD2 ، TIR2 (مستقبلات الحصيلة / إنترلوكين 2) ، RING ، و Hsp70 بشكل كبير في م. المرتزقة وذوات الصدفتين الأخرى (الشكل 2). يدعم التوسع المشترك لـ TNFs و BIRs على وجه الخصوص التنظيم المعزز لموت الخلايا المبرمج ، حيث يعمل TNF و IAP (البروتين المحتوي على BIR) معًا في تنظيم مصير الخلية. على سبيل المثال ، يعدل TNF الاستجابات الخلوية المتنوعة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والنخر ، عبر مجمعات إشارات متعددة تنشأ من عائلة TNFR الفائقة ، مع cIAPs كمكون متكامل ، بما في ذلك توظيف محولات إشارة المصب [11 ، 12 ، 13]. عدد الجينات المحتوية على مجال BIR في المحار الصلب ، 177 نسخة ، هو الأعلى (ص & lt 0.001) بين جميع metazoans التي تمت دراستها (الشكل 2). يشير التوسع الكبير في المجالات المتعلقة بالاستماتة في المحار الصلب وذوات الصدفتين الأخرى إلى أن ذوات الصدفتين قد يكون لها مجموعة جينية قوية ومعقدة لتنظيم موت الخلايا المبرمج والضغط الخلوي.

توزيع مجالات بروتين Pfam المرتبطة بالاستماتة في الرخويات والميتازوان الأخرى. سيدتي ، Mercenaria mercenaria Rph ، Ruditapes philippinarum افا ، Azumapecten farreri ميلا في الساعة ، موديولوس فيليبيناروم Cvi ، كراسوستريا فيرجينيكا Pfu ، بينكتادا فوكاتا CSQ ، أقحوان الكريسومالون Lgi ، لوتيا جيجانتيا Bgl ، Biomphalaria glabrata أكا ، أبليسيا كاليفورنيكا Adu ، Architeuthis dux أوبي ، الأخطبوط bimaculoides Cte ، كابيتيلا تيليتا حرو ، هلوبديلا روبوستا آمي ، أبيس ميليفيرا ديمي ، ذبابة الفاكهة سوداء البطن هسا ، الانسان العاقل Bfl ، ورم برانكيوستوما فلوريدي Branchiostoma floridae نفي ، Nematostella vectensis. اختصارات المجال: Bcl-2 ، وبروتينات منظم موت الخلايا المبرمج ، و Bcl-2 family CARD ، ومجال توظيف caspase DED ، ومجال مستجيب الموت IAP ، ومثبط مجال موت الخلايا المبرمج NACHT ، وهو مجال موجود في بروتينات NAIP و CIITA و HET-E و TEP1 NB-ARC ، محول ربط للنيوكليوتيدات يتم مشاركته بواسطة APAF-1 ، وبعض منتجات الجينات R ، و CED-4 TIR ، ومجال مستقبلات TIR / interleukin-l TNF ، وعامل نخر الورم TNFR ، ومستقبل عامل نخر الورم zf-C3HC4_3 ، إصبع الزنك ، نوع C3HC4 (حلقة الاصبع). التوسع في م. المرتزقة أو تتم الإشارة إلى ذوات الصدفتين من خلال تصحيح كبير ص القيمة (ص & lt 0.001) ، من اختبارات Chi-square للتمثيل الزائد ، باستخدام جميع الجينات المشروحة كخلفية. يشير اللون ، من الرمادي إلى الأحمر ، إلى الترتيب من الأسفل إلى الأعلى

لاستكشاف أدوار IAPs في الاستجابة المناعية الفطرية للبطلينوس الصلب ، أجرينا تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات الموزونة (WGCNA) على 39 نسخة من 10 أعضاء ، مع التركيز على الجينات التي تظهر زيادة الاتصال في الدملمف ، والبنكرياس ، والخياشيم ، الأعضاء الأولية في الدفاع الأولي ضد مسببات الأمراض. أولاً ، حددنا 19548 جينًا مرتبطًا بالأعضاء تم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين أي عضوين. حدد تحليلنا 11 وحدة جينية ذات وحدات بنية وحمراء وفيروزية تظهر ارتباطًا كبيرًا مع الدملمف والكبد والبنكرياس والخياشيم ، على التوالي (الشكل 3 أ ، ب). أظهر المحار الصلب بصمات واضحة خاصة بالأعضاء. ترتبط الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل بارز في الدملمف بشلالات التكميل والتخثر ومسار إشارات TNF ، وتمت مشاركة هذه التواقيع النصية مع الرخويات الأخرى (ملف إضافي 5: الشكل S3). على وجه الخصوص ، تم إثراء الجينات المرتبطة بالاستماتة على نطاق واسع في نسخ الدملمف والخياشيم (ملف إضافي 5: الشكل S3 وملف إضافي 6: الشكل S4). في شبكة التعبير المشترك لأفضل 20 مسارًا لـ KEGG المخصب في الدملمف الجينات المعبر عنها على وجه التحديد (جينات الوحدة البني) ، كانت مسارات موت الخلايا المبرمج مترابطة مع إشارات NF-kappa B ، وإشارات TNF ، وإشارات مستقبلات تشبه NOD ، ومسارات السرطان. تشير هذه النتائج إلى أن التفاعلات بين هذه المسارات تشكل شبكة تنظم موت الخلايا وبقائها ، والتوازن الخلوي ، والمناعة في البطلينوس الصلب (الظل البني في الملف الإضافي 6: الشكل S4). في أفضل 20 مسارًا لـ KEGG المخصب للوحدة البنية ، تم شرح العديد من الجينات على أنها IAPs وإثرائها في مسارات موت الخلايا المبرمج (29/45). أظهرت IAPs أيضًا تعبيرًا مشتركًا مكثفًا وقويًا مع جينات أخرى في الوحدة البني عند قطع معامل الارتباط الموزون 0.35 (أعلى 3 ٪) (ملف إضافي 7: الشكل S5). تشير هذه النتيجة إلى أن تنظيم موت الخلايا المبرمج قد يلعب دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية في البطلينوس الصلب.

تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات الخاصة بالأعضاء في المحار الصلب ، مع التركيز على جينات الاستجابة المناعية المرشحة في الدملمف. أ بناء نموذجي لشبكة التعبير الجيني لـ 39 عينة. تي ، الخصية ، المبيض أماه ، عباءة جي ، الخيشوم فو ، القدم في ، الأمعاء Hep ، الكبد والبنكرياس St ، المعدة الإعلانية ، المقربة هيم ، الدملمف. ب مصفوفة الارتباط بين الوحدات والأعضاء. ص يتم تقديم القيمة في كل خلية ، ويشير اللون إلى معامل الارتباط

توسيع IAP عن طريق الازدواج الترادفي والرجوع إلى الخلف

كانت بعض الجينات المحتوية على مجال BIR (الشكل 2) غير مكتملة ، وحدد التحليل الإضافي 159 IAPs حسن النية (الشكلان 1 أ و 4 ب) ، مما أعطى المحار الصلب أكبر ذخيرة جينية لـ IAP تم تحديدها حتى الآن. تضمن توسيع عائلة IAP في المحار الصلب أحداثًا متعددة من الازدواج الترادفي المحلي والرجوع إلى الخلف. لوحظ ازدواج ترادفي هائل على الكروموسومات (Chr) 5 و 6 و 7. من بين 159 IAPs ، كان 59 (37.1٪) مرتبطًا بكثافة في المصفوفات الترادفية على Chr 5 ، بينما كان 22 (13.8٪) و 12 (7.6٪) مكررة بالترادف في Chr 6 و 7 ، على التوالي (الشكل 1 أ). تحتوي مصفوفة المثال على 6 عمليات IAP مكررة بشكل مترادف تقع عند 12،280–12،370 كيلو قاعدة (kb) على Chr 5 ، تم نسخها في نفس الاتجاه دون وجود جينات أخرى متناثرة بينهما (الشكل 5 أ).

معماريات المجال لـ IAPs من المحار الصلب (يسار ، المحدد في هذه الدراسة) والبشر (يمين ، معدل من Kocab et al. 2016) (أ) شجرة النشوء والتطور من 159 IAPs من البطلينوس الصلب (ب) توزيع معماريات المجال (ج) ورقم intron من مجموعات مختلفة من النشوء والتطور (د)

الاختلاف في ملف تعريف التعبير عن IAPs المكرر في المحار الصلب. أ الازدواجية الترادفية لستة IAPs في ملف

منطقة 90 كيلو بايت ، مع اختلاف في التعبير بين الأعضاء والمراحل المختلفة أثناء التعرض الجوي. ب الضغط الانتقائي على عمليات الشراء داخل التطبيق الستة المكررة. ج يمثل تنبؤ النموذج الجيني لخطوط IAPs الستة المكررة introns ، بينما تمثل المربعات exons. يتم تلوين المناطق التي ترميز المجالات المختلفة وفقًا لذلك. تشير الأرقام الموجودة فوق الإنترونات إلى مرحلة كل intron. د حدود المجالات الموجودة في عمليات الشراء داخل التطبيق ذات البطلينوس الصلب

بالإضافة إلى الازدواجية الترادفية ، كانت نسبة كبيرة من IAPs (51 ، 32.1 ٪) بدون intron ويبدو أنها موزعة عشوائيًا عبر الكروموسومات (ملف إضافي 8: الجدول S11) ، مما يشير إلى إعادة العرض. كشفت التحليلات الوراثية لـ 159 IAPs عن 6 مجموعات منفصلة ذات مسافات وراثية صغيرة و 4 جينات أخرى خارج هذه الكتل. يحتوي Clade 1 على 49 IAPs (الشكل 4 ب) ، منها 42 كانت بدون intron وأظهرت بنى مجال مماثلة (exon واحد يشفر BIR بدون إنترون) ، مما يوحي بانفجار رجعي من جين "أبوي" شائع. وبالتالي ، فإننا نتوقع أن كلا من الازدواج الترادفي والرجوع للخلف غذى التوسع التطوري لـ IAPs في جينوم البطلينوس الصلب.

ميكانيكيًا ، يمكن تسهيل تكرار الجينات بواسطة TEs المرتبطة. كشف تحليل توزيع TE أن ترانسبوزونات الحمض النووي قد تم إثرائها بشكل كبير (ص & lt 0.01) حول جينات IAP (متوسط ​​الكثافة = 0.12) مقارنة بالجينات الأخرى في الجينوم (متوسط ​​الكثافة = 0.05) ، بينما لم تُظهر الأنواع الأخرى من TEs (بما في ذلك LINE و LTR و SINE) فرقًا كبيرًا (ملف إضافي 9: الشكل . S6). تشير هذه النتيجة إلى أن ترانسبوزونات الحمض النووي ربما لعبت دورًا في التوسع الهائل لجينات IAP في جينوم البطلينوس الصلب.

أدى التغيير المتكرر للمجال إلى تنوع هيكل IAP

لفهم تطور IAPs بعد الازدواجية ، قمنا بتصنيف بنية المجال لـ IAPs البطلينوس إلى سبعة أنواع ، A-G (الشكل 4 أ) ، بناءً على عدد نسخ مجالات BIR و RING ، والتي تعد مفتاحًا لوظيفة IAPs. تم العثور على خلط واسع النطاق للمجال في عمليات الشراء داخل التطبيق ذات المحار الصلب. كما يتضح من تصنيف بنية المجال وتحليل النشوء والتطور (الشكل 4 ب) ، يمكن اشتقاق IAPs التي تتجمع معًا من نفس الجين السلفي ، وتختلف بنية المجال داخل نفس المجموعة. كانت Clam IAPs في نفس الكليد (2-5) تتألف من 3 إلى 6 أنواع مختلفة من بنية المجال ، مع كل كليد له بنية مجال مهيمنة واحدة (& gt 50٪) ونسب متفاوتة من الأنواع المشتقة (36٪ إلى 43٪) (الشكل . 4 ج). يُشتق هيكل المجال المتنوع من خلط المجال ، أي عن طريق اكتساب أو فقدان مجالات BIR / RING. على سبيل المثال ، عرضت IAPs 6 المكررة بالترادف في منطقة 90 كيلو بايت في Chr 5 (الشكل 5 أ ، الملف الإضافي 8: الجدول S11) ، ثلاثة أنواع من معماريات المجال ، C و F و G (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى حدث خلط المجال أثناء أو بعد الازدواج الترادفي.

للتحقيق في كيفية تأثير خلط المجال الشراء داخل التطبيق بنية الجين ، درسنا بنية intron-exon لمجالات BIR و RING و BIRC6 و UBA (الشكل 5 د). بشكل ملحوظ ، عرض كل مجال هياكل intron-exon المحفوظة للغاية. بينما كان مجال RING مرتبطًا داخل exon واحد في نهاية الجين ، فإن معظم IAPs المحار الصلب (باستثناء تلك التي نشأت من retroposition) كان لها نطاق BIR أولي امتد إلى أول اثنين من exons. تم دائمًا اتباع أول اثنين من exons المشفر BIR بواسطة exon آخر محاط بالمرحلة 0 والمرحلة 1 (أو 2) introns (بين قوسين في الشكل 5 ج ، د). تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن إدراج مجال BIR مع exon المتتالي في IAP كوحدة نمطية متعددة exon ، أو سمحت أطوار intron المرافقة والداخلية المماثلة للنطاقات بأن تكون "مختلطة ومطابقة" من مجموعة من مبنى exon الفردي كتل.

لتحديد ما إذا كانت IAPs المكررة قد تعرضت لضغط اختيار مختلف ، قمنا بحساب النسبة غير المرادفة إلى نسبة الاستبدال المرادفة (Ka / Ks) لـ 6 IAPs المكررة بالترادف على Chr 5 (الشكل 5 أ). كان Ka / Ks لجميع IAPs المكرر الستة أقل بكثير من 1 (ص تتراوح القيم من 0

9.74E − 47 ، الشكل 5 ب) ، مشيرًا إلى أنها مقيدة وظيفيًا عن طريق تنقية الانتقاء. يشير تباين Ka / Ks من 0.0817 إلى 0.4456 إلى أن الجينات المكررة قد شهدت مستويات مختلفة من اختيار التنقية ، والتي قد تكون مهمة للتسلسل والتباعد الوظيفي.

الاختلاف الوظيفي لعمليات الشراء داخل التطبيق المكررة

لفهم كيفية استجابة IAPs للضغوط البيئية ، أجرينا RNA-seq في الأيام 0 و 8 و 16 بعد تعرض المحار البالغ للتعرض الجوي. كان هناك 632 جينًا منظمًا و 343 جينًا خاضعًا للتنظيم في اليوم الثامن ، بينما تم تنظيم 506 جينًا منظمًا و 532 جينًا خاضعًا للتنظيم في اليوم السادس عشر. (الشكل 6 ج ، د). يشير هذا إلى أن موت الخلايا المبرمج كان مهمًا وظيفيًا للحفاظ على التوازن ، حيث يؤدي التعرض الجوي إلى انخفاض في مستويات الأس الهيدروجيني والأكسجين ، مما يؤدي إلى اختلال وظيفي في التوازن الخلوي. يُعزى الإثراء في الجينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج بشكل أساسي إلى التعبير عن عائلة IAP: 17 من 27 جينًا معبرًا تفاضليًا (DEGs) من مسار موت الخلايا المبرمج كانت IAPs في اليوم الثامن ، و 12 من 23 في اليوم 16 (الشكل 6 أ) ، ب). إلى جانب التعرض الجوي ، قمنا أيضًا بمقارنة نسخ المحار الصلب المعرض لدرجة حرارة عالية وأكسجين منخفض وملوحة منخفضة. إجمالاً ، تم التعبير عن 134 من IAPs بشكل تفاضلي تحت ضغوط بيئية واحدة على الأقل ، وبين 27 DEGs التي تشترك فيها جميع عوامل الإجهاد ، كانت ثلاثة منها IAPs (ملف إضافي 10: الشكل S7). تشير هذه النتائج إلى أن أكثر من 84٪ من IAPs الموسعة (134 من 159) متورطة في الاستجابة للضغط في المحار الصلب بخصوصية ملحوظة ، مما يسلط الضوء على أهمية توسيع وتنويع IAPs في الاستجابة للتوتر والتكيف.

استجابة النسخ من المحار الصلب المعرض لضغط التعرض للهواء وتباعد تعبير IAP. أ, ب قطع البركان للجينات المعبر عنها التفاضلية (DEGs) (8 أيام مقابل 0 أيام و 16 يومًا مقابل 0 أيام). ج, د، مسارات KEGG المخصبة في DEGs (8 أيام مقابل 0 أيام و 16 يومًا مقابل 0 أيام). ه, F التعبير المنسق للبطلينوس الصلب IAPs بين الأعضاء وأثناء التعرض الجوي. تم اعتبار IAPs بمتوسط ​​FPKM & lt 0.1 صامتة ومستبعدة

عرضت IAPs المكررة ملفات تعريف متنوعة للتعبير ، سواء مكانيًا في أعضاء مختلفة أو مؤقتًا أثناء الإجهاد البيئي ، مما يشير إلى الاختلاف الوظيفي والتنسيق. لا يُعزى الاختلاف الوظيفي فقط من خلال التعبير المخصص للأعضاء عن عمليات IAP المختلفة (الشكل 6 ج) ، ولكن أيضًا من خلال الاستجابة التفاضلية أو نمط التعبير لأعضاء IAP لضغوط بيئية محددة ، متمثلة في الاستجابة المتباينة للتعرض الجوي (الشكل 6 د) ) ، والحساسية المتباينة أو الاستجابة للضغوط البيئية المختلفة (ملف إضافي 11: الشكل S8) ، حيث أظهرت IAPs المعبر عنها بالدملمف (الوحدة البنيّة من WGCNA) اختلافًا واضحًا في التعبير استجابة لضغوط مختلفة. تعتبر IAPs في الكليد الأخضر حساسة لإجهاد التعرض الجوي ، في حين أن الكليد الأرجواني حساس للملوحة المنخفضة ، وفي الكليد الأزرق حساس للإجهاد الحراري.

سواء على مستوى الكليد وفيما يتعلق بالنوع الهيكلي (ملف إضافي 12: الشكل S9 والملف الإضافي 13: الشكل S10) ، كان التعبير عن IAPs استجابة للإجهاد البيئي متغيرًا بدرجة كبيرة. بشكل عام ، أظهرت IAPs في clades 2 و 3 و 5 ديناميكيات تعبير مماثلة حيث تم تنظيمها جميعًا عندما واجهت المحار ضغطًا حراريًا أو تناضحيًا أو جويًا ، ولكن بمستويات تعبير مختلفة وخصوصية أعضاء. مقارنةً بـ IAPs في clades 2 و 3 و 5 ، كانت تلك الموجودة في clade 4 أقل حساسية للمتغيرات البيئية وأظهر clade 6 أنماط تعبير معاكسة تقريبًا. IAPs بأنواع هيكلية مختلفة (A

E) عرضت أيضًا أنماط تعبير متباينة ، على سبيل المثال ، أظهرت IAPs من النوع D والتي كانت حساسة بشكل خاص للضغوط البيئية خصوصية واضحة للأعضاء: التعبير العالي في الوشاح والتعبير المنخفض في الدملمف. في المقابل ، أظهرت IAPs من النوع B استجابة مماثلة للإجهاد البيئي ولكن كان لها أعلى تعبير في الدملمف. أظهر IAPs من النوع E اتجاهًا معاكسًا لأنواع B و D في الاستجابة لضغوط متعددة.

يتم تعزيز فكرة التعبير المنسق بعد الازدواج من خلال ستة عمليات IAP مكررة بالترادف على Chr 5 (الشكل 5 أ) ، والتي أظهرت الاستجابة التأسيسية للتعرض الجوي وتحيز التعبير عن الأعضاء المتباينة: وصلت الجينات 5.357 و 3.578 إلى أعلى مستويات التعبير في 8 أيام بعد تم التعبير عن التعرض الجوي ، 5.359 و 3.360 بشكل كبير في 16 يومًا ، ولم يظهر 3.61 و 3.62 تغييرات كبيرة. فيما يتعلق بالتعبير التفاضلي بين الأعضاء ، أظهر 5.357 أعلى تعبير في الخياشيم ، 5.357

تم التعبير بشكل بارز عن 5.360 في الدملمف ، بينما تم التعبير عن 5.361 و 5.362 بشكل موحد.

تطور ذخيرة IAP بين الشعب المتعددة

لاستكشاف الأصل التطوري لـ IAPs الموجودة ، تم تطبيق نهج phylostratigraphic مع قطع E & lt e −10 لتقدير أعمار IAPs والجينات الخاصة بالأعضاء. حددنا 10 رتب للتطور الوراثي (phylostrata) بناءً على قاعدة بيانات تصنيف NCBI وباستخدام أول phylostratum (PS1) كنقطة منشأ للحياة الخلوية (أي أقدم الجينات) ، وآخر نسالة (PS10) كنسب محار صلب قيد التحقيق (أي أصغر الجينات). أظهرت الجينات الخاصة بالأعضاء في الدملمف والبنكرياس والخياشيم نمطًا مشابهًا للعمر الجيني ، حيث احتوت الجينات الخاصة بالبنكرياس الكبدية فقط على نسبة مئوية متزايدة من الجينات الأكبر سنًا (+ 11٪) وانخفضت نسبة الجينات الأصغر (- 9٪). معظم IAPs الموسعة للبطلينوس الصلب تسبق تاريخ أصل Metazoan (50٪) و Bilateria (47٪) ، بينما ظهر IAP واحد (ID ، Mme.02 g01599.1 ، يشار إليه بمثلث أزرق في الشكل 7 أ) لأول مرة مع ظهور حقيقيات النوى. كان هذا الجين فريدًا من حيث الهيكل والحجم بطول 90.83 كيلو بايت (ملف إضافي 8: الجدول S11) واحتوى على مجال BIR6 (نوع G2 في الشكل 4 أ). وبالمثل ، فإن IAP للثدييات ، المسمى Apollon (4.88 كيلو بايت ويحتوي أيضًا على مجال BIR6) ، يختلف هيكليًا عن IAPs التقليدية الخاصة بالميتازوان ويظهر تماثلًا لبروتين في الخميرة [33]. تدعم نتائجنا وجود سلالتين من IAPs ، أحدهما هو IAPs الذي يحتوي على BIR6 وهو قديم ونشأ في حقيقيات النوى ، والنسب الآخر هو IAPs المحتوية على BIR والتي تشترك فيها الكائنات متعددة الخلايا [33].

أصل IAPs المحار الصلب وتطور IAP في سلالات ميتازوان مختلفة. أ الأصل التطوري للـ IAPs والجينات الخاصة بالأعضاء في المحار الصلب. تحليلات Phylostratigraphic للجينات IAPs (الأزرق) والجينات الخاصة بالدم اللمف (البني) والجينات الكبدية الخاصة (الحمراء) والجينات الخيشومية (الفيروز) عبر 10 phylostrata. تم تضمين الجينات فقط التي تم إرجاع ضربة انفجار كبيرة واحدة على الأقل لها (& lt e 10). ب توسع وتقلص ذخيرة IAP عبر 18 نوعًا من سلالات ميتازوان مختلفة. يتم تعيين أحداث الكسب والخسارة الجينية لشجرة الأنواع ، يشار إليها بأرقام خضراء وحمراء ، على التوالي. تشير الأرقام الموجودة في المربعات الصفراء إلى رقم IAP الأسلاف المتوقع لكل عقدة. الكتلة الزرقاء تشير إلى Bivalvia. ميلا في الساعة ، موديولوس فيليبيناروم Pfu ، بينكتادا فوكاتا Cvi ، كراسوستريا فيرجينيكا افا ، Azumapecten farreri سيدتي ، Mercenaria mercenaria Rph ، Ruditapes philippinarum أكا ، أبليسيا كاليفورنيكا Bgl ، Biomphalaria glabrata Lgi ، لوتيا جيجانتيا CSQ ، أقحوان الكريسومالون Adu ، Architeuthis dux أوبي ، الأخطبوط bimaculoides Cte ، كابيتيلا تيليتا حرو ، هلوبديلا روبوستا آمي ، أبيس ميليفيرا ديمي ، ذبابة الفاكهة سوداء البطن هسا ، الانسان العاقل Bfl ، ورم برانكيوستوما فلوريدي Branchiostoma floridae نفي ، Nematostella vectensis. ج توزيع IAPs مع بنى المجال المختلفة في 19 نوعًا من Metazoa. تشير علامة النجمة إلى توسيع معماريات المجال في ذوات الصدفتين مع تصحيح كبير ص القيمة (ص & lt 0.0001) من اختبارات Chi-Square للتمثيل الزائد ، باستخدام جميع الجينات المشروحة كخلفية

حددنا أيضًا IAPs السليمة بين 19 نوعًا واستخدمنا إطارًا للتطور لتتبع المصائر التطورية لهذه IAPs عبر شعب حيوانية متعددة (الشكل 7 ب). تم تقدير أن أحدث سلف مشترك (MRCA) لجميع metazoans كان لديه 13 IAPs ، في حين أن التوسع المتتالي لعائلة IAP حدث على الأرجح في سلف الرخويات المشتركة والأنساب اللاحقة. كان هناك توسع كبير في ذوات الصدفتين لم يحدث في الأصناف الأخرى (الكتلة الزرقاء في الشكل 7 ب). كان توسع IAPs ذات الصدفتين خاصًا بالنسب بشكل أساسي (الشكل 8) ، حيث تجمعت المتماثلات داخل نفس النوع معًا ، مما يشير إلى أن توسعها حدث بعد الانتواع. يشير التوسع الكبير في IAPs في الأنساب متعددة الصدفتين إلى تطور متقارب لتنظيم موت الخلايا المبرمج المحسن في ذوات الصدفتين الثابتة التي يتعين عليها التعامل مع الإجهاد البيئي دون القدرة على التجنب.

التحليل الوراثي ل IAPs من Mercenaria mercenaria (سيدة) ، كراسوستريا فيرجينيكا (Cvi)، Crassostrea gigas (CGI) ، Biomphalaria glabrata (Bgl) و الانسان العاقل (Hsa) تم إنشاء Dendrogram باستخدام تحليل Bayesian مع نموذج استبدال WAG. تم تعريف معمارية المجال في الشكل 4 أ

سيطرت الأنواع الهيكلية للمجال B و C و F و G1 على IAPs ذات الصدفتين الموسعة بشكل كبير (الشكل 7 ج) ، والتي تتكون من واحد أو اثنين من مجالات BIR ، مقترنة أو غير مقترنة بمجال RING. لقد اختلفوا بشكل كبير عن أنواع IAP الأخرى (مثل A و D و E و G2 و G3) ، والتي تحتوي على عدد أقل من النسخ (& lt 5) في جميع الشعب الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون ترتيب المجال لأنواع D و E و G3 قد حدث عبر كسب المجال (BIR إضافي) ، والخسارة (مجال RING مفقود) ، والخيار المشترك (PC4 المختار) ، بينما يكتب H و I في البشر من المحتمل أن تكون ابتكارات هيكلية اختارت مجالات CARD و NACHT و NOD2_WH و NLRC4_HD.


نتائج ومناقشة

يسبق قمع منظمات التمثيل الغذائي الرئيسي للنسخ تراكم الدهون أثناء إجهاد ER

يمكن تحفيز تراكم الدهون في الكبد عن طريق التعرض لمثبط ارتباط الجليكوزيل المتصل بالجليكوزيل (TM) أو مثبط البروتوزوميب بورتيزوميب ، أو عن طريق الإفراط في التعبير عن بروتين عميل ER غير منظم مثل عامل التخثر الثامن [GenBank: <"النوع": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_001161373.1" ، "term_id": "238624181" ، "term_text": "NM_001161373.1" >> NM_001161373.1] (Rutkowski et al.، 2008 Zhang et al.، 2011 Chikka et al.، 2013). كل من هذه العلاجات تنشط إما UPR أو استجابة الإجهاد المتكاملة ويؤدي كل منها إلى تغييرات مماثلة نوعياً في التعبير عن الجينات الأيضية الرئيسية في الكبد. تتضمن هذه الجينات كلاً من عوامل النسخ والعوامل المساعدة المشاركة في التحكم في عملية التمثيل الغذائي وكذلك الأهداف النهائية لهذه العوامل التي تشفر الإنزيمات الوظيفية الرئيسية المشاركة في تقويض الدهون ، والتمنيع ، والتخزين ، والإفراز (Rutkowski et al. ، 2008).

لم يتم تحليل التنظيم الزمني لهذه التغييرات التنظيمية للجينات قبل وبعد ظهور تراكم الدهون. من المحتمل أن تكون أقدم هذه الأحداث المنظمة مرتبطة ميكانيكيًا بشكل مباشر بالاستعراض الدوري الشامل و / أو استجابة الإجهاد المتكاملة. وبالتالي ، قمنا بفحص المسار الزمني لتراكم الدهون الكبدية في الفئران البرية استجابةً لـ TM ، وهو محفز أكثر قوة لإجهاد ER والتنكس الدهني من المحفزات الأخرى (Chikka et al. ، 2013). راقبنا تراكم الدهون من خلال ثلاثة معايير متميزة: تراكم زيت Red O في قطرات الدهون من أقسام الكبد المجمدة الطازجة (الشكل & # x200B (الشكل 1A) 1A) الكشف الكيميائي المناعي للقطيرة الدهنية المرتبطة بالبروتين الدهني (ADRP) [GenBank: <" اكتب ":" entrez-nucleotide "،" attrs ": <" text ":" NM_007408.3 "،" term_id ":" 116235488 "،" term_text ":" NM_007408.3 ">> NM_007408.3] (الشكل & # x200B (Figure1B) 1B) والتقييم البيوكيميائي المباشر لمستويات الدهون الثلاثية في الكبد (الشكل & # x200 ب (الشكل 1 ج). 1 ج). كانت النتائج من جميع المقايسات الثلاثة متشابهة: زاد محتوى الدهون الكبدي بشكل كبير في النقطة الزمنية 8 ساعات. لذلك ، من المحتمل أن تحدث الأحداث التنظيمية الجينية الرئيسية المسؤولة عن تغيير التمثيل الغذائي للدهون قبل 8 ساعات ، في حين أن الأحداث التي تحدث بعد 8 ساعات بعد التحدي هي تأثيرات ثانوية على الأرجح تساهم في اضطراب الدهون بشكل عرضي ، إن وجدت.

يسبب إجهاد ER تراكم كبير للدهون الكبدية خلال 8 ساعات. (أ) تم تحدي الفئران C57BL / 6J بـ 1 مجم / كجم TM للأوقات المحددة ، وتم تجميد الكبد في OCT ، وتم تلطيخ الدهون باستخدام شريط مقياس الزيت الأحمر O. = 50 & # x003bcm. (ب) مثل (أ)، باستثناء محتوى الدهون تم تقييمه عن طريق التلوين المناعي للبروتين الدهني ADRP. شريط المقياس = 50 & # x003bcm. (ج) مثل (أ)، فيما عدا محتوى الدهون الثلاثية تم قياسه بالمقايسة اللونية بعد استخلاص الدهون المحايدة. ص & # x0003c 0.001 بواسطة One-Way ANOVA. ن = 3 عينات لكل نقطة زمنية. تظهر أشرطة الخطأ هنا وفي أي مكان آخر تعني & # x000b1 SDM.

بعد ذلك ، قمنا بفحص توقيت تنشيط UPR وتنظيم الجينات الأيضية.أدى TM إلى الحد الأقصى من الربط المعتمد على IRE1 & # x003b1 لـ Xbp1 مرنا في غضون ساعتين استمر هذا الربط خلال 8 ساعات ولكنه تقلص في نقاط زمنية لاحقة (الشكل & # x200 ب (الشكل 2 أ). 2 أ). وبالمثل ، تم تنظيم كل جين مستهدف خاضع للتنظيم الدوري الشامل بشكل كبير بمقدار ساعتين ، وبلغ ذروته عند 4 & # x020138 ساعة ، وتضاءل بعد ذلك (الشكل & # x200 ب (الشكل 2 ب). 2 ب). تعتمد هذه الجينات بدرجات متفاوتة على نشاط كل من مسارات الاستعراض الدوري الشامل الثلاثة (هاردينج وآخرون ، 2003 لي وآخرون ، 2003 وو وآخرون ، 2007). يتم تنظيمها بشكل موحد بمقدار 2 ساعة يشير إلى أن كل من المنشطات النسخية الثلاثة المنظمة لـ UPR & # x02014ATF6 & # x003b1 و ATF4 و XBP1 & # x02014 نشطة وظيفيًا في هذه النقطة الزمنية المبكرة جدًا.

قمع متدرج للجينات الأيضية أثناء إجهاد ER. (أ) أشكال التقسيم (Spl) وغير المقسمة (لنا) من Xbp1 تم الكشف عن mRNA بواسطة RT-PCR لمجموع الحمض النووي الريبي المعزول من كبد الفئران المعالجة بمركبة (المركبات) أو 1 مجم / كجم TM للأوقات المحددة. يظهر كل ممر حيوانًا منفصلاً. يتم عرض الصورة في شكل مقلوب من الأسود إلى الأبيض لمزيد من الوضوح البصري. (ب) تم تحديد التعبير عن الجينات المستهدفة UPR المحددة بواسطة qRT-PCR من الحيوانات الموضحة في (أ)، مع Btf3 و ببيا تستخدم كضوابط تطبيع. يتم إعطاء التعبير هنا والأرقام اللاحقة في السجل2 مقياس نسبة إلى حالة السيارة المعالجة. هنا وفي أي مكان آخر ما لم يُذكر: * ص & # x0003c 0.05 # ص & # x0003c 0.1 للطالب ثنائي الذيل ر-اختبار. (C & # x02013F) تم تقييم التعبير عن الجينات الأيضية بواسطة qRT-PCR كما في (ب)، وتم تجميع الجينات وفقًا للنقطة الزمنية التي يتم فيها تقليل التنظيم (ص & # x0003c 0.1) لأول مرة. يتم سرد العملية التي يشارك فيها كل جين.

قمنا بعد ذلك بتحليل تعبير الجينات المشاركة في استقلاب الدهون ، بما في ذلك كل من منظمات النسخ والإنزيمات الأيضية التي تحد من المعدل الرئيسي. قمنا بتجميع الجينات وفقًا للنقطة الزمنية التي تم فيها تنظيمها أولاً. لاحظنا على الفور أنه على عكس الجينات المستهدفة للاستعراض الدوري الشامل التقليدي ، فإن تنظيم الجينات الأيضية يحدث على مراحل. تضمنت المجموعة الأولى التي تم تنظيمها مجموعة مختارة من عوامل النسخ والعوامل المساعدة. المُنظم Pgc1b [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_133249.2" ، "term_id": "118131021" ، "term_text": "NM_133249.2" >> NM_133249. 2] تم تخفيض التنظيم بمقدار ساعتين على الرغم من أنه ليس عند 4 ساعات (الشكل & # x200B (الشكل 2C) ، 2C) ، مما يجعل التوقيت الحقيقي للقمع غامضًا. على النقيض من ذلك ، من خلال 4 ساعات من coregulator Pgc1a [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_008904.2" ، "term_id": "238018130" ، "term_text": "NM_008904.2" >> NM_008904. 2] والمنشطات النسخ سيبا [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_007678.3" ، "term_id": "131886531" ، "term_text": "NM_007678.3" >> NM_007678. 3] و بارا [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_001113418.1" ، "term_id": "164663879" ، "term_text": "NM_001113418.1" >> NM_001113418. تم قمع 1] (الشكل & # x200B (الشكل 2C). 2C). يساهم PGC-1 & # x003b2 في تكوين الدهون ، وأكسدة الأحماض الدهنية ، وإنتاج وإفراز VLDL (Lee et al. ، 2003 Lin et al. ، 2003 ، 2005a ، b Wolfrum and Stoffel ، 2006) ، ويساهم PGC-1 & # x003b1 في العمليتان الأخيرتان من هذه العمليات (Louet et al.، 2002 Lin et al.، 2005a Rhee et al.، 2006). C / EBP & # x003b1 له أدوار عامة في توازن الطاقة بما في ذلك التمثيل الغذائي للدهون والجلوكوز ، بينما PPAR & # x003b1 هو منظم رئيسي لأكسدة الأحماض الدهنية (Desvergne et al. ، 2006).

تم تنظيم الجينات في أوقات لاحقة & # x02014i.e. ، بعد ظهور تراكم الدهون الواضح & # x02014 ، بما في ذلك كل من منظمات النسخ والجينات النهائية التي ترميز إنزيمات الحد من المعدل في عمليات التمثيل الغذائي ، كما هو موضح في الشكلين 2D & # x02013F. تشير هذه النتائج إلى أن PGC-1 & # x003b1 و C / EBP & # x003b1 و PPAR & # x003b1 (وربما PGC-1 & # x003b2) هي على الأرجح أول جينات التمثيل الغذائي للدهون التي ينظمها إجهاد ER. علاوة على ذلك ، فإن العمليات اللاحقة لهذه العوامل & # x02014 أي أكسدة الأحماض الدهنية والتكوين الحيوي للبروتين الدهني ونقله & # x02014 هي أول من يتأثر بآليات تنظيم الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن الجينات الشحمية لا تتغير إلا بعد ذلك بوقت طويل (18 ساعة) ، فإنهم يقترحون أن تثبيط تكون الدهون هو نتيجة ثانوية لإجهاد ER ، وربما يحدث نتيجة لردود فعل سلبية عندما تبدأ الدهون في التراكم. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن تضفير XBP1 ناتج عن إجهاد ER ، لم نجد أي دليل على أن التعبير الجيني المولد للدهون كان حفز في ظل هذه الظروف.

يؤدي حذف ATF6 & # x003b1 إلى تفاقم قمع الجينات الأيضية

الفئران التي تفتقر إلى ATF6 & # x003b1 ، بينما تبدو طبيعية وصحية على ما يبدو ، تظهر تنكس دهني دراماتيكي عند التحدي مع TM (Rutkowski et al. ، 2008 Yamamoto et al. ، 2010). يتضح هذا النمط الظاهري من خلال تلطيخ ADRP في الشكل & # x200B Figure3A 3A ، وهو ينشأ من عدم القدرة على استعادة توازن ER عند التحدي. لذلك ، استنتجنا أنه يمكن استخدام هذه الفئران لفضح تغييرات التعبير الجيني التي ينظمها الإجهاد والتي تكمن حقًا في عدم انتظام الدهون ، حيث يجب تضخيم هذه التغييرات في Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات. الميزة الثانية لهذه الحيوانات هي أنه يمكن استخدامها لتحديد تغييرات التعبير المستجيبة للإجهاد حقًا تلك التي تنتج عن خصائص TM المستقلة عن الإجهاد ER والتي لا يُتوقع أن تختلف بين النوع البري و Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 حيوانات ، حيث لا يُعتقد أن ATF6 & # x003b1 يعمل خارج سياق إجهاد ER ، وحذفه لا يغير النشاط الدوائي الظاهر لـ TM (Rutkowski et al. ، 2008).

فقدان Atf6& # x003b1 يؤدي إلى تفاقم التنكس الدهني وقمع الجينات الأيضية على المدى الطويل. (أ) نوع البرية أو Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 تم تحدي الفئران بـ 1 مجم / كجم TM أو مركبة لمدة 48 ساعة ، وتم إجراء التلقيح المناعي ADRP كما في الشكل & # x200B الشكل 1. 1. شريط المقياس = 50 & # x003bcm. (B & # x02013F) نوع البرية أو Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 تم تحدي الفئران باستخدام 1 mg / kg TM أو مركبة لمدة 34 ساعة ، وتم تقييم تعبير mRNA العالمي بواسطة Affymetrix microarray. يتم عرض تعبير محدد بالصفيف للجينات المشار إليها. تم ترتيب الجينات في نفس المجموعات كما في الشكل & # x200B الشكل 2. 2. تم حساب الدلالة الإحصائية من خلال الطالب ثنائي الذيل ر-اختبار ، مقارنة التعبير في علاج TM Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات ضد الحيوانات البرية المعالجة بـ TM. ن = 3 حيوانات لكل مجموعة. (ز) تم علاج الفئران باستخدام TM أو السيارة لمدة 48 ساعة كما هو الحال في (أ)، وتم تحديد التعبير عن الجينات المشار إليها بواسطة qRT-PCR. تم تحديد الأهمية كما في (B & # x02013F).

لقد اقتربنا من هذا الهدف من خلال تحدي النوع البري و Atf6& # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات لفترة ممتدة (34 ساعة) مع TM ، ثم تحديد ملامح التعبير الجيني العام بواسطة ميكروأري. لقد اخترنا هذا النهج جزئيًا لأننا استخدمنا سابقًا تنميط المصفوفة الدقيقة لتوصيف التعبير الجيني في سلالات الفئران نفسها بعد 8 ساعات من تحدي TM (Rutkowski et al. ، 2008). إن إجراء دراسة ميكروأري ثانية بشريحة جينية متطابقة في وقت لاحق سيوفر لنا فرصة فريدة لتحديد ، لكل جين في المصفوفة ، تعبيره في نمطين وراثيين مختلفين ، في ظل نظامين مختلفين للعلاج (المركبة و TM) في مرتين مختلفتين.

من خلال وجود 8 مجموعات متميزة من الظروف التجريبية ، توقعنا أنه يمكننا البدء في تحديد مجموعات من الجينات المنظمة بشكل منسق ، بما في ذلك الجينات الأيضية الأكثر استجابة لإجهاد ER. اعتمد هذا على افتراض أن الجينات التي هي جزء من مسار وظيفي مشترك (في هذه الحالة ، التمثيل الغذائي للدهون) ينبغي تنظيمها بالمثل. تم استخدام هذا النهج بشكل كبير في الخميرة ، ومؤخرًا في خلايا الثدييات المستزرعة ، لكشف المكونات المخفية سابقًا للجهاز الإفرازي والمسارات الأخرى ذات الأهمية (Schuldiner and Weissman ، 2013). هنا ، كان هدفنا هو استنتاج المنظمين النسخيين المخفيين باستخدام الأنماط الزمنية للتعبير الجيني كمخرج.

من بين الجينات الأيضية التي تم فحصها ، لم يتم تنظيم أي منها بواسطة إجهاد ER في أي من النمط الجيني في 34 ساعة. اثنان من الجينات & # x02014the المنظمين الدهون والكوليسترول سريبف 1 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_011480.3" ، "term_id": "146134488" ، "term_text": "NM_011480.3" >> NM_011480. 3] و سريبف 2 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_033218.1" ، "term_id": "73661203" ، "term_text": "NM_033218.1" >> NM_033218. 1] & # x02014 تم تقليل تنظيمهما بالتساوي في كلا النوعين الجيني (الأشكال ثلاثية الأبعاد ، E). ومع ذلك ، فقد تم التعبير عن الغالبية العظمى من الجينات بمستويات طبيعية أو شبه طبيعية في الحيوانات البرية ، ولكن تم كبتها بشدة في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 حيوانات (الشكلان 3C & # x02013F). أكد التنميط qRT-PCR لأخذ عينات من هذه الجينات من تجربة مستقلة هذه النتائج (الشكل & # x200B (Figure3G). 3G). تتوافق هذه البيانات مع الفكرة القائلة بأن إجهاد ER الحاد يمنع أكسدة الأحماض الدهنية والتكوين الحيوي للبروتين الدهني على مستوى التعبير الجيني ، ولا يحفز التعبير الجيني المولّد للدهون.

تتجمع مجموعات الجينات ذات الصلة وظيفيًا مؤقتًا

مكننا وجود هذه الحالات التجريبية الثمانية المتميزة من مقارنة السلوك العالمي للتعبير الجيني الكبدي استجابةً لإجهاد ER في وقت مبكر مقابل الأوقات المتأخرة في الحيوانات العادية مقابل تلك التي تعاني من ضعف UPR. توضح خريطة الحرارة التي تُظهر الجينات الخاضعة للتنظيم TM ملاحظتين: أولاً ، كانت اختلافات التعبير الجيني بين الطرز الوراثية أكثر شمولاً في 34 ساعة منها في 8 ساعات. ثانيًا ، عند 34 ساعة ، عادت العديد من الجينات إلى التعبير الطبيعي أو شبه الطبيعي في الحيوانات البرية ، لكنها ظلت منظمة ، أو أصبحت أكثر تنظيمًا في نفس الاتجاه ، في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات.

ثم تم تصنيف كل جين بناءً على ما إذا كان قد تم تنظيمه أو تنظيمه أو عدم تغييره بسبب إجهاد ER في النوع البري و اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات بعد 8 أو 34 ساعة من الإجهاد. وبالتالي ، يمكن أن يقع الجين في أي من ملفات تعريف التعبير 81 (3 & # x000d7 3 & # x000d7 3 & # x000d7 3). يتم توفير التخصيصات لجميع المجسات في الجدول S1. تمكنا من تحليل الجينات بهذه الطريقة جزئيًا لأن عددًا قليلاً جدًا من الجينات اختلفت في تعبيرها الأساسي (أي غير المرهق) بين الأنماط الجينية تقريبًا ، كانت جميع التغييرات المعتمدة على النمط الجيني في التعبير ناتجة عن TM ، لذلك لم تكن اختلافات التعبير القاعدية مربكة (Rutkowski) وآخرون ، 2008).

لأن اتفأصبحت الحيوانات 6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 أكثر تشابكًا من الحيوانات البرية ، ولم يتم متابعة الجينات التي لم يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين الأنماط الجينية على 34 ساعة من علاج TM ، حيث من غير المحتمل أن تكون مساهمين رئيسيين في النمط الظاهري steatotic. على الرغم من أن 54 تركيبة متبقية من التعبير كانت ممكنة (3 & # x000d7 3 & # x000d7 3 & # x000d7 2) ، فإن 90 بالمائة من الجينات تنقسم إلى 9 فئات فقط (A & # x02013I ، الشكل & # x200B Figure4B). 4 ب). ثم تم إعطاء كل فئة من فئات الجينات تمثيلًا رسوميًا لنمط التعبير لأعضائها (الأشكال 4C & # x02013G). كانت مجموعتا الجينات الأكثر اكتظاظًا بالسكان (المجموعتان أ و ب) هي تلك التي لم تتأثر بالإجهاد في الساعة 8 في أي من النمط الجيني ، أو في الحيوانات من النوع البري في 34 ساعة ، ولكن تم تنظيمها لأعلى أو لأسفل ، على التوالي ، عند 34 ح في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 حيوانات (الشكل & # x200B (الشكل 4E). 4E). من بين الجينات الأيضية الموضحة في الأشكال & # x200B الأشكال 2 ، 2 ، & # x200B ، 3 ، 3 ، عدد من هذه المجموعة B ، وتشمل جينات ترميز إنزيمات تحد من معدل المعدل في كل مسار لأكسدة الأحماض الدهنية & # x02014أكوكس 1, Cpt1a، و Cyp4a10 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_015729.3" ، "term_id": "429484482" ، "term_text": "NM_015729.3" >> NM_015729. 3، <"type": "entrez-nucleotide"، "attrs": <"text": "NM_013495.2"، "term_id": "162287141"، "term_text": "NM_013495.2" >> NM_013495.2 و <"type": "entrez-nucleotide" و "attrs": <"text": "NM_010011.3" و "term_id": "227116293" و "term_text": "NM_010011.3" >> NM_010011.3 ] ، التي تتحكم في أكسدة البيروكسيسوم ، والميتوكوندريا ، والأكسدة الميكروسومية ، على التوالي. نظرًا لأن التعبير عن هذه الجينات لا يتم تغييره حتى النقطة الزمنية اللاحقة ، فمن غير المرجح أن تكون مرتبطة بشكل وثيق بالاستعراض الدوري الشامل ، ولكنها تمثل على الأرجح تأثيرات غير مباشرة & # x02014 على سبيل المثال ، لقمع PPAR & # x003b1. تضمنت المجموعتان التاليتان الأكثر اكتظاظًا بالسكان (المجموعتان C و D) تلك الجينات التي تم تنظيمها إما لأعلى أو لأسفل في وقت مبكر في كلا النوعين الجيني ، وعاد تعبيرها إلى المستويات الطبيعية في الحيوانات البرية بحلول 34 ساعة ولكنها ظلت منظمة في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات. من بين الجينات الأيضية ، تضمنت المجموعة D العوامل المُكوِّنة Pgc1a و Pgc1b. كانت المجموعات E و F ذات صلة وثيقة بهذه المجموعات ، والتي تضمنت الجينات التي تم رفعها أو خفضها في وقت مبكر في كلا النوعين ، والتي تم تعزيز هذا التنظيم في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات في 34 ساعة. الجينات الأيضية الأخرى سريعة التنظيم ، سيبا و بارا، تم العثور عليها في المجموعة F.

تجميع الجينات وفقًا للتنظيم الزمني في النوع البري و اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات. (أ) تم تجميع التعبير عن كل مسبار على ميكروأري Affymetrix الموصوف في الشكل & # x200B الشكل 3 مع بيانات التعبير من مجموعة متطابقة منشورة مسبقًا تقارن التعبير الجيني في النوع البري و اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات 8 ساعات بعد التحدي مع السيارة أو 2 مجم / كجم TM (Rutkowski et al. ، 2008). لكل نقطة زمنية ، تم تحديد التعبير باستخدام السجل2 مقياس نسبة إلى الحيوانات البرية المعالجة بالمركبات في ذلك الوقت. مجسات فقط تظهر بشكل كبير (ص & # x0003c 0.05) اختلافات التعبير (1.5 ضعف ، أو & # x000b10.58 على السجل2 المقياس) في واحد أو أكثر من الحالات الأربعة (من النوع البري أو اتفيتم عرض 6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 عند 8 أو 34 ساعة) بواسطة خريطة الحرارة ، والتي تمثل

45000 مجس على المصفوفة. يظهر مدى التنظيم الأعلى أو السفلي من خلال شدة اللون الأحمر أو الأزرق ، على التوالي. يصور كل عمود مستوى التعبير المتوسط ​​بين الحيوانات الثلاثة لكل مجموعة. (قبل الميلاد) تميز كل مسبار في المصفوفة بتعبيرها بالطرق الأربع التالية ، مع تحديد الاختلافات على أنها & # x0003e 1.5 أضعاف ، ص & # x0003c 0.05: (1) لأعلى أو لأسفل أو بدون تغيير في الحيوانات البرية المعالجة بعلامة TM عند 8 ساعات بالنسبة إلى النوع البري المعالج بالمركبة (2) لأعلى أو لأسفل أو بدون تغيير في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 TM الحيوانات المعالجة عند 8 ساعات بالنسبة إلى النوع البري المعالج بـ TM (3) مثل (1) ولكن 34 ساعة و (4) نفس (2) ولكن 34 ساعة. تم تقسيم الجينات التي أظهرت اختلافًا بالمعيار (4) إلى مجموعات بناءً على سلوكها فيما يتعلق بهذه المعايير ، ويظهر عدد الجينات في المجموعات التسع الأكثر اكتظاظًا بالسكان في (ب). مجموعة الجينات التي تم تنظيمها بواسطة إجهاد ER في الحيوانات البرية في كلتا النقطتين الزمنيتين ، ولكنها كانت أقل تنظيمًا في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات & # x02014i.e. ، الجينات التي يمكن فهمها مباشرة على أنها ATF6 & # x003b1 تعتمد على & # x02014 تم أيضًا حسابها. (ج) يوفر مفتاحًا لتوضيح أنماط التعبير الجيني. (D & # x02013G) نمط التعبير لكل مجموعة من المجموعات الجينية الموضحة في (ب). وتشمل هذه الجينات الموضحة في الشكل & # x200B الشكل 2 2 (تلك التي لم تندرج في إحدى هذه المجموعات موضحة في الشكل S1) بالإضافة إلى الجينات المشاركة في معالجة بروتين ER الموجودة في المجموعة E. بالنسبة للجينات التي يمثلها أكثر من مسبار واحد ، يتم عرض السلوك الأكثر تمثيلًا و / أو الأكثر اتساقًا مع بيانات qRT-PCR.

كانت المجموعتان D و F الأكثر أهمية بالنسبة لنا لأنهما يمثلان تلك الجينات التي من المرجح أن تكون مرتبطة ميكانيكيًا تقريبًا بإشارات UPR ، حيث تم تنظيمها بسرعة من خلال إجهاد ER وبما أن تعبيرها طويل المدى تزامن مع إجهاد ER المستمر وتفاقمه. تراكم الدهون في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات. كانت المجموعة F على وجه الخصوص جديرة بالملاحظة لأن نظيرتها من الجينات المنتظمة & # x02014Group E & # x02014 تضمنت عددًا من الجينات المعروفة بأنها أهداف مباشرة لعوامل نسخ UPR وبالتالي فهي مرتبطة تقريبًا بإشارات UPR (الشكل & # x200B (الشكل 2D 2D).

كما دعم صحة النهج مجموعة الجينات التي تم تنظيمها بواسطة إجهاد ER في الحيوانات البرية في كلتا النقطتين الزمنيتين ، ولكن لم يتم تنظيمها في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات في كلا النقطتين الزمنيتين (Figure & # x200B (Figure4G). 4G). ستلائم هذه الجينات الملف الشخصي المتوقع للأهداف المباشرة لـ ATF6 & # x003b1. على الرغم من وجود عدد قليل نسبيًا من الجينات في هذه المجموعة ، إلا أنها تضمنت تلك الموصوفة بالفعل كأهداف مباشرة لـ ATF6 & # x003b1 ، بما في ذلك Erp72, ص58 IPK ، Erdj3، و ديرل 3 (وو وآخرون ، 2007 Yamamoto وآخرون ، 2007). يدعم هذا الاكتشاف فكرة أن الجينات المحكومة يمكن تمييزها بناءً على ملف تعريف التعبير الخاص بها في هذا الإعداد.

تم تعزيز هذه الفكرة من خلال تحليل المسار. تم تحليل الجينات من كل مجموعة من المجموعات العشر (A & # x02013I و ATF6) من أجل الإثراء الوظيفي لمسارات علم الوجود الجيني (GO) باستخدام FunNet (Prifti et al. ، 2008). كدليل على المفهوم ، أسفر تحليل المسار لجينات المجموعة ATF6 عن & # x0201cunfolded بروتين استجابة & # x0201d باعتبارها العملية الأكثر إثراءً بشكل كبير ، والتي من المتوقع أن تشمل مجموعة تشمل ATF6 & # x003b1 أهدافًا مباشرة (الشكل & # x200B (الشكل 5 أ). 5 أ). تم إثراء الجينات التي تمثل العمليات ذات الصلة بعملية التمثيل الغذائي للدهون في جميع المجموعات الخاضعة للتنظيم & # x02014B و D و F و G & # x02014 ولكن ليس في المجموعات المنتظمة A و C و E و H و I (الأشكال 5 ب ، ج). على العكس من ذلك ، تم إثراء كل مجموعة من المجموعات المنتظمة في الجينات التي تمثل المسارات ذات الصلة بتخليق البروتين والاتجار به وتدهوره. من المعروف أن تنشيط UPR أثناء إجهاد ER يزيد نسبيًا من آلية التكوُّن الحيوي للبروتين الخلوي من خلال عمل منشطات النسخ الرئيسية المنظمة من UPR XBP1 و ATF4 و ATF6 (Harding et al.، 2003 Lee et al.، 2003 Wu et al.، 2007).وبالتالي يشير تحليل المسار هذا ، على الأقل في الكبد ، إلى أن كبت الجينات المشاركة في استقلاب الدهون يمثل تركيزًا منسقًا لتنشيط UPR.

تتجمع الجينات ذات الصلة وظيفيًا عن طريق التنظيم الزمني. (A & # x02013C) تعرضت كل مجموعة من المجموعات الجينية في الشكل & # x200B الشكل 4 لتحليل مسار علم الجينات باستخدام FunNet. تم بعد ذلك إعادة ترتيب أهم سبعة مسارات لإثراء المسار حسب عدد الجينات من تلك المجموعة التي كانت Pathway & # x0201chits ، & # x0201d مع المسارات التي تحتوي على أكثر & # x0201chits & # x0201d المدرجة أعلى. لأسباب تتعلق بالمساحة ، يتم عرض خمسة من هذه المسارات السبعة من كل مجموعة. لم يتم إثراء عملية التمثيل الغذائي للدهون بأي حال من الأحوال بين مجموعات الجينات المنتظمة. في (ب)، يتم سرد المسارات ذات الصلة باستقلاب الدهون باللون الأسود ، والمسارات الأخرى باللون الرمادي. في (ج)، يتم سرد المسارات ذات الصلة بمعالجة البروتين باللون الأسود.

يحدد التحليل الجيني الوظيفي HNF4 & # x003b1 كمنظم قريب للتعبير الجيني الأيضي أثناء إجهاد ER

كنا نرغب في تسخير القوة الإحصائية لمقارنات المصفوفة الدقيقة لدينا من أجل التنبؤ بعوامل النسخ التنظيمية التي تم تغيير نشاطها بسبب إجهاد ER ، فمن المرجح أن تكون مرتبطة ميكانيكيًا تقريبًا بالاستعراض الدوري الشامل. لتحقيق ذلك ، أخضعنا الجينات في كل مجموعة للتحليل باستخدام oPOSSUM (Ho Sui et al. ، 2005) ، الذي يبحث في منطقة المروج / المحسن لكل جين عن مواقع ربط عامل النسخ المتوافق من قاعدة بيانات JASPAR CORE. لإثبات صحة هذا النهج ، أسفرت الجينات في المجموعة ATF6 عن عامل النسخ NFYA [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_001110832.1" ، "term_id": "161016830"، "term_text": "NM_001110832.1" >> NM_001110832.1] باعتبارها النتيجة الوحيدة ذات الدلالة الإحصائية (الشكل & # x200B (الشكل 6 أ). 6 أ). من المعروف أن ATF6 & # x003b1 يتناقص مع NFYA لتنظيم النسخ من المروجين الذي يحتوي على عناصر ERSE و ERSE II (Yoshida et al. ، 2000 ، 2001 Kokame et al. ، 2001). لم يتم إثراء NFYA في أي مجموعة أخرى ، مما يؤكد خصوصية الخوارزمية.

يشير توقع عامل النسخ إلى ELK4 و HNF1 & # x003b1 و NR2F1 و HNF4 & # x003b1 كعقد تنظيمية مخفية في تنظيم الجينات الكبدية المعتمدة على الإجهاد. (A & # x02013C) خضعت كل مجموعة من مجموعات الجينات في الشكل & # x200B الشكل 4 لتحليل موقع واحد من oPOSSUM ، والذي يبحث في المناطق التنظيمية (في هذه الحالة ، & # x000b12000 bp من موقع بدء النسخ) لمواقع الربط المحتملة لعوامل النسخ المحددة في قاعدة بيانات JASPAR CORE. اقتصرت النتائج على أ ض- الدرجة & # x0003e 10 ودرجة فيشر & # x0003c 0.01. (د) البيانات من (ج) تم تصورها باستخدام مكون BINGO الإضافي لبرنامج Cytoscape ، مع الأخذ في الاعتبار الجينات ذات الصلة بعملية التمثيل الغذائي للدهون فقط كما هو موضح من تحليل GO. يتم عرض مواقع الربط التي تنبأ بها oPOSSUM باستخدام خطوط متقطعة ، بينما تظهر الجينات ذات مواقع الربط المؤكدة HNF4 & # x003b1 بخطوط صلبة.

نظرًا لوجود الجينات المشاركة في التمثيل الغذائي للدهون في المجموعات B و D و F و G ، فقد سعينا إلى العثور على نتائج موجودة في تلك المجموعات وليس غيرها ، مع التركيز بشكل خاص على المجموعتين D و F ، نظرًا لأن هذه المجموعات تحتوي على الجينات التي تستجيب مبكرًا. بشكل ملحوظ ، مواقع الربط لعاملي النسخ & # x02014HNF4 & # x003b1 و NR2F1 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_010151.2" ، "term_id": "111185901" ، "term_text": "NM_010151.2" >> تم إثراء NM_010151.2] & # x02014 في المجموعات B و D و F ولكن ليس في أي مجموعة أخرى (الأشكال 6 ب ، ج). هذه العوامل لها مواقع ربط إجماع متشابهة (Kimura et al. ، 1993 Ellrott et al. ، 2002 Schmidt et al. ، 2010) ، موضحًا سبب فصلهم معًا في هذا التحليل. تشير هذه النتيجة إلى أن نشاط هذين المنشطين النسخيين قد تم تغييره أثناء إجهاد ER ، نظرًا لأن الجينات التي تحتوي على مواقع ربط لهذه العوامل يتم تقليلها من خلال إجهاد ER ، ويتفاقم تنظيمها بسبب الإجهاد المستمر الذي لوحظ في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الفئران. على العكس من ذلك ، تم إثراء المجموعات A و C و E للجينات التي تحتوي على مواقع ربط محتملة لـ ELK4 ، والمعروف أيضًا باسم SRF Accessory Protein (SAP) -1 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": < "text": "NM_007923.2" ، "term_id": "153792361" ، "term_text": "NM_007923.2" >> NM_007923.2].

المجموعة الأولى ، وتشمل الجينات التي يتم تنظيمها عن طريق إجهاد ER طويل المدى في الحيوانات البرية ومن ثم تنظيمها في اتفتم إثراء 6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات للربط بواسطة CREB1 [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide"، "attrs": <"text": "NM_001037726.1"، "term_id" : "158966706"، "term_text": "NM_001037726.1" >> NM_001037726.1] ، والتي تشترك في تسلسل ربط إجماعي مع عامل النسخ المترجم ERB (Zhang et al. ، 2006). يتم تنشيط CREBH عن طريق تحلل البروتين الناجم عن ، من بين المحفزات الأخرى ، إجهاد ER ، وينظم التعبير عن جينات استجابة المرحلة الحادة والجينات الأيضية (Zhang et al. ، 2006 ، 2012 Luebke-Wheeler et al. ، 2008). وفقًا لذلك ، فإن الجينات في المجموعة الأولى لديها ملف تعريف متوقع لأهداف CREBH & # x02014 أي أنها يتم تنظيمها بواسطة إجهاد ER ، ومزيد من التنظيم في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الحيوانات ، حيث يتفاقم إجهاد ER. ومع ذلك ، لم يتم إثراء جينات التمثيل الغذائي للدهون في المجموعة الأولى ، ولم يتم إثراء موقع ارتباط CREB1 في المجموعات التي تحتوي على جينات التمثيل الغذائي للدهون. بالإضافة إلى ذلك ، بخلاف الجين المشفر لمصل الأميلويد P (أبس) [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide"، "attrs": <"text": "NM_011318.2"، "term_id": "226958496"، "term_text": "NM_011318.2" >> NM_011318 .2] ، لم يتم تنظيم معظم الجينات التي تشفر بروتينات استجابة المرحلة الحادة (بروتينات SAA ، CRP ، التخثر وبروتينات التخثر ، وما إلى ذلك) بشكل كبير في أي نقطة زمنية في أي من النمط الجيني ، مما يشير إلى أن نشاط CREBH أثناء حسن النية قد يكون إجهاد ER (على عكس الذيفان الداخلي أو السيتوكينات المؤيدة للالتهابات أو المحفزات الأخرى) ضئيلًا ، ويمكن بدلاً من ذلك تنظيم الجينات في المجموعة الأولى بواسطة عامل آخر من عائلة CREB.

ELK4 هو جزء من عائلة عوامل النسخ الثلاثية (TCF) التي تتفاعل مع عامل استجابة المصل (SRF) (Dalton and Treisman ، 1992). لم يتم وصف دور ELK4 في التعبير الجيني الكبدي ، ولم يتم ربط ELK4 ارتباطًا مباشرًا بإجهاد ER. تم إثبات تنشيط ELK4 بواسطة الفسفرة المعتمدة على JNK (Janknecht and Hunter ، 1997) ، و JNK [GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_016700.4" ، "term_id": "225637490"، "term_text": "NM_016700.4" >> يتم تنشيط NM_016700.4 بواسطة إجهاد ER (Urano et al. ، 2000). وبالتالي ، فإننا نتوقع أن نشاط ELK4 يمكن تنظيمه أثناء إجهاد ER في الكبد بواسطة JNK أو كينازات MAP أخرى لتعزيز التعبير عن الجينات في المجموعات A و C و E. NR2F1 ، المعروف أيضًا باسم COUP-TF ، هو مستقبل يتيمة. يؤدي الحذف إلى الوفاة في الفترة المحيطة بالولادة مع خلل شديد في تمايز الخلايا العصبية (Qiu et al. ، 1997). وظيفته في الكبد أقل وضوحًا ، على الرغم من أنه ثبت أنه يعمل على تنشيط النسخ بشكل تآزري مع HNF4 & # x003b1 (Ktistaki and Talianidis ، 1997 Yanai et al. ، 1999).

يتم التعبير عن HNF4 & # x003b1 بقوة في الكبد والأمعاء والكلى والبنكرياس. الحذف مميت أثناء التثبيط (Chen et al. ، 1994). الفئران المصابة بحذف خاص بالكبد من HNF4 & # x003b1 تتطور إلى تنكس دهني مصاحب لضعف ApoB و متتب التعبير وإنتاج VLDL (Hayhurst وآخرون ، 2001). أدت الضربة القاضية الكبدية لـ HNF4 & # x003b1 عن طريق توصيل الفيروس الغدي إلى تنكس دهني وخلل في إنتاج VLDL ، جنبًا إلى جنب مع التعبير المتضائل بشكل أساسي عن مجموعة من الجينات المشاركة في التمثيل الغذائي للدهون ، بما في ذلك العديد من تلك المذكورة هنا (Yin et al. ، 2011). وبالتالي ، يؤدي فقدان HNF4 & # x003b1 إلى ظهور العديد من التغيرات الجينية الأيضية للدهون التي يسببها إجهاد ER. أدى الإفراط في التعبير عن HNF4 & # x003b1 في خلايا الكبد الأولية إلى تنظيم العديد من هذه الجينات نفسها ، وإن لم يكن من سريبف 1 ولا سريبف 2 (ين وآخرون ، 2011). هذا الاستثناء ملحوظ لأن سريبف 1 و سريبف 2 هي واضحة بين الجينات الأيضية التي تم تحليلها هنا في حقيقة أن تنظيمها أقل ليس تفاقم عند 34 ساعة في اتف6 & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 الفئران (الأشكال ثلاثية الأبعاد ، E). تميزت مواقع ربط HNF4 & # x003b1 في جينوم كبد الفأر بـ ChIP-seq (Schmidt et al. ، 2010) ، وتم تأكيد الجينات في المجموعات B و D و F أهداف HNF4 & # x003b1 (الشكل & # x200B (الشكل 6D 6D ).

تتنبأ نتائجنا ، جنبًا إلى جنب مع النشاط المعروف لـ HNF4 & # x003b1 ، بأن إجهاد ER يؤدي إلى تضاؤل ​​نشاط HNF4 & # x003b1 ، وأن هذا يحدث كحدث مبكر في تنظيم الجينات الأيضية عن طريق إجهاد ER. لاختبار هذا التوقع ، قمنا بتحليل ارتباط HNF4 & # x003b1 بالمواقع المحددة بـ ChIP-seq في مناطق المروج / المحسن لثلاثة من أقدم الجينات الأيضية المنظمة الأربعة & # x02014 منظمات النسخ سيبا, Pgc1a، و بارا (الداني Pgc1b المروج / المحسن لا يحتوي على موقع ربط HNF4 و # x003b1 متوقع أو تم التحقق من صحته). وجدنا أن علاج الحيوانات باستخدام TM لمدة 8 ساعات لم يغير التعبير الكلي (الشكل & # x200B (الشكل 7 أ) 7 أ) أو التوطين النووي (الشكل & # x200 ب (الشكل 7 ب) 7 ب) لـ HNF4 & # x003b1. ومع ذلك ، وفقًا لتوقعاتنا ، وجدنا أن ارتباط الكروماتين HNF4 & # x003b1 انخفض بشكل ملحوظ في عدة مواقع في سيبا و Pgc1a المروجين عند معاملة الحيوانات مع TM (الشكل & # x200B (الشكل 7C). 7C). لم يكن هذا التناقص موحدًا في العديد من المواقع داخل المروجين الثلاثة التي أظهرت ارتباط HNF4 & # x003b1 دون تغيير (الشكل & # x200B (الشكل 7 أ). 7 أ). تشير هذه النتائج معًا إلى أن إجهاد ER يقلل من نشاط HNF4 & # x003b1 في مواقع محددة في الجينوم من خلال آلية مستقلة عن مستوى التعبير HNF4 & # x003b1.

تناقص HNF4 & # x003b1 ملزم عند سيبا و Pgc1a المروجين أثناء إجهاد ER. (أ ، ب) تم تحدي الفئران من النوع البري باستخدام 1 مجم / كجم TM لمدة 8 ساعات ، وتم تقييم التعبير عن HNF4 & # x003b1 بواسطة طقطقة مناعية (أ) أو الكيمياء المناعية (ب). شريط المقياس = 50 & # x003bcm. (ج) تم تقييم ارتباط HNF4 & # x003b1 بالمناطق التنظيمية للجينات المشار إليها بواسطة chromatin-IP. يتم إعطاء المناطق بالنسبة إلى موقع بدء النسخ ، وتتوافق مع المناطق المحددة بواسطة تحليل ChIP-seq (Schmidt et al. ، 2010). ن = 3 & # x020134 حيوانات لكل مجموعة. كان الاسترداد النموذجي للمواد الجينومية في العينات التي تحتوي على جسم مضاد HNF4 & # x003b1 في نطاق 0.1 & # x020131 في المائة من إجمالي المدخلات. * ص & # x0003c 0.05 بواسطة ر-اختبار.


أساليب

تحليل النشوء والتطور والتنبؤ ببنية الجينات

تضمنت تسلسل الببتيد المستخلص لأفراد عائلة الأنسولين 20 من Mollusca و 30 من Ecdysozoa و 51 من Deuterostomia (البيانات التكميلية 1). تم التعرف على تقويم العظام المفترض بين الإنسان والمحار من خلال الانفجار المتبادل الأفضل إصابة مع ه- حد للقيمة 1e − 5 56. تم استرداد تسلسل Pdx من NCBI (الشكل التكميلي 3). تم إجراء محاذاة متعددة باستخدام MAFFT 7.221 57 باستخدام خوارزمية L-INS-I ، وتم تقليمها باستخدام TrimAl باستخدام المعلمات –gt 0.9–st 0.001 –cons 40 58. شيدت الأشجار التطورية باستخدام RAxML 59 باستخدام النموذج التطوري LG + Gamma + Invariant و 1000 مكررة من bootstrap. تم استخدام UGENE 60 لتصور المحاذاة. بالنسبة لتسلسلات المحار ILP 23 ، تم توقع ببتيدات الإشارة بواسطة SignalP 4.1 61 ، سلاسل الببتيد الناضجة المتوقعة من أزواج متجاورة من المخلفات الأساسية 62. لتصور محاذاة Pdx ، تم ترميز ألوان الأحماض الأمينية وفقًا لدرجة حفظها التطوري وخصائصها الفيزيائية والكيميائية باستخدام مخطط الألوان Zappo من Jalview 63.

مادة حيوانية

محار المحيط الهادئ البالغ من العمر ثلاث سنوات (جيجاس) المستخدمة لـ qPCR والتهجين في الموقع ، RNA-seq و ATAC-seq واستنساخ الجينات كانت من سوق أكسفورد المغطى ، وبحسب ما ورد تم جمعها من الساحل الاسكتلندي ، وتم تأقلمها في مياه البحر الاصطناعية عند 16 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل الاستخدام. تم تغذية المحار مع سبيرولينا مسحوق أثناء الثقافة. تم تأكيد تحديد الأنواع عن طريق تسلسل جين السيتوكروم أوكسيديز الأول في الميتوكوندريا. تم تشريح أنسجة من ثلاثة أفراد للحصول على ملامس شفوية وخياشيم وعباءة وعضلة بيضاء مقرّبة وعضلة مقرّبة شفافة وخلايا عصبية وقلب وهيموليمف وغدد تناسلية ذكرية وغدد التناسلية الأنثوية والبنكرياس والمعدة والأمعاء لاستخراج الحمض النووي الريبي الفوري.

استخراج الحمض النووي الريبي و qPCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول TRIzol القياسي (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وعُولج باستخدام DNase I (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم خلط الحمض النووي الريبي المأخوذ من ثلاثة أفراد بالتساوي قبل توليف أول جديلة (كدنا) مع GoScript ™ RT (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات المورد. مواد أولية لـ qPCR على المحار مثل الأنسولين الجينات Pdx وكرقابة داخلية cgEF1a ترد في البيانات التكميلية 4. تم إجراء Realtime qPCR على نظام Prime Pro 48 الحقيقي qPCR (Techne ، المملكة المتحدة). تم استخدام طريقة 2 t لحساب القياس الكمي النسبي (RQ) للجينات المستهدفة. تم استخدام برنامج R 64 للإحصاء والتخطيط.

فحص لكروماتين يمكن الوصول إليه عبر transposase

للحفاظ على الأسمولية ، تم استخدام محلول ملحي فوسفات Dulbecco المعدل (MDPBS) لاحتضان خلايا المحار طوال الوقت. تم تحضين شظايا أنسجة الكبد والبنكرياس الطازجة في 0.8 مجم / مل من كولاجيناز P (Sigma ، 11213857001) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة وتم تنقيطها بلطف كل 5 دقائق لتحرير الخلايا المفردة. تم ترشيح تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر (BD Falcon ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ونقلها إلى أنبوب جديد ، وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق عند 500 × ز. تم التخلص من المادة الطافية ، وتم تعليق الحبيبات في MDPBS لتحليل صلاحية الخلية وعد الخلايا. لكل تفاعل ، تم جمع 50000 خلية عند 1000 × ز لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. اتبع تفاعل التحويل والتنقية وبناء المكتبة والتقدير الكمي الطرق المعمول بها 65 ، بما في ذلك العلامات باستخدام مجموعة Nextera DNA (Illumina FC-121-1030) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وتضخيم الحمض النووي المرتبط باستخدام NEB Next High-Fidelity 2X PCR ماستر ميكس 11 دورة. تم تقييم جودة المكتبة باستخدام Agilent Tapestation.

تم تسلسل عينتين باستخدام 40 نقطة أساس قراءات مقترنة بنهاية على منصة Illumina NextSeq 500 مما أعطى 43 و 17.5 مليون زوج من القراءات ، على التوالي. تم تعيين القراءات باستخدام Bowtie 2 (الإصدار 2.1.0) إلى جيجاس الجينوم v.9 الذي تم الحصول عليه من NCBI أسفر عن 79.8٪ و 74.8٪ من القراءات المتسلسلة المعينة على التوالي للجينوم النووي. تم استدعاء القمم في كل عينة باستخدام MACS2 (الإصدار 2.1.1) باستخدام معلمات "نموذج - تغير حجم 250 - نولامبا". تم استعادة القمم فقط في كل من التكرارات وأطول من 100 نقطة أساس تم الاحتفاظ بها. تم ترشيح القمم بشكل أكبر لإزالة المناطق المتداخلة مع التسلسلات المتكررة المستمدة من نموذج الشرح المتكرر المدمج (مرشح RepeatModeler 66 و DUST 67 و TRF 68) ، مما أسفر عن ما مجموعه 168206 توافقًا في الآراء حول مناطق الكروماتين المفتوحة على مستوى الجينوم. تم تعيين قمم الإجماع للجينات التي يشير إليها جيجاس نماذج الجينات التي تم الحصول عليها من NCBI باستخدام برنامج Homer (الإصدار 4.9) annotatePeaks.pl. من هذا التعليق التوضيحي ، تم استنتاج مناطق الكروماتين المفتوحة المقابلة للعناصر التنظيمية المفترضة القريبة والبعيدة. تم إجراء تحليل TFBS باستخدام مجموعة Gimme motifs (الإصدار 0.11.1) 69. تم الحصول على المصفوفات الموزونة للمواضع (PWMs) لـ TFBSs الفردية المقابلة لـ PDX1 (مواقع PDX1 البشرية: M5712_1.02 ، M5713_1.02 ، M6415_1.02 ومواقع الماوس Pdx1: M0976_1.02 ، M1952_1.02) من مكتبة CIS-BP على الإنترنت لـ عوامل النسخ وزخارفها المرتبطة بالحمض النووي في http://cisbp.ccbr.utoronto.ca 70. تم تجميع الماوس والبشر PWMs باستخدام أمر مجموعة gimme لإنتاج نموذج كتلة متوسط ​​واحد (موقع إجماع) 'Pdx_Average_2' نتج عن تجميع 3 مواقع (Human M5713_1.02 ، Mouse M1952_1.02 ، Human M6415_1.02) ، مجموعة ثانية يتكون من نموذج واحد يتوافق مع موقع مزدوج من شكلين TAAT بجانب بعضهما البعض (Human M5712_1.02) وعزف منفرد ثالث يتوافق مع موقع TAAT الأقل شهرة (Mouse M0976_1.02). تم إنشاء مناطق الخلفية باستخدام الأمر "gimme background -random" باستخدام جيجاس الجينوم كمرجع. تم الحصول على قيم العتبة بناءً على تسلسلات الخلفية باستخدام أمر gimme threshold مع "fpr = 0.01" لكل من PWMs الفردية و Pdx_Average_2 TFBS. تم تحديد TFBS باستخدام مسح gimme باستخدام قيم القطع التي تم الحصول عليها من خطوة "gimme threshold" على جميع قمم الإجماع. حدد كل من Pdx_Average_2 و Pdx_M1952_1.01 PWMs مواقع Pdx1 التي تم التحقق من صحتها تجريبياً والموجودة في −1806 (TTCTAATTAC) على سقالة 737: 266144-266153 لكنها فشلت في التعرف على القواعد المرافقة (5′-T و C-3 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك ، هناك مجموعة مسبقة التجميع مكونة من 623 نموذجًا تم إنشاؤها من زخارف CIS-BP (http://dx.doi.org/https://doi.org/10.6084/m9.figshare.1555851) 71 ، مواقع TFBS (v .3) ، لمسح مجموعة ذروة الإجماع كما هو موضح أعلاه. لم يتم استرداد مواقع Pdx1 المحددة من قبل أي PWM متجمعة أخرى من Homeodomain تؤكد خصوصية التحليل.

تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير التفاضلي

تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) باستخدام تسلسل 75 زوجًا من النهايات المزدوجة (PE) على منصة Illumina HiSeq 4000 (Illumina ، Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) من مكتبة Hpatopancreas TruSeq من نفس الفرد المستخدم في ATAC- فيما يليها. تم الحصول على إجمالي 33.11 مليون قراءة PE بعائد 4880 ميجا بايت Q20. تم تحليل البيانات جنبًا إلى جنب مع قراءات التسلسل المنشورة من أعضاء إضافية (بما في ذلك "الغدة الهضمية" ، ويحتمل أن تكون هي نفسها مثل الكبد) 23. تم تعيين قراءات التسلسل الخام إلى جينوم المحار باستخدام HISAT2 ومعالجتها أيضًا باستخدام الأدوات StringTie و Ballgown 72. تم استخدام عدد القراءة المعين لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام edgeR 73 ، ومستويات التعبير الجيني التي تم تحديدها كميا على أنها شظايا لكل كيلو قاعدة لكل مليون قراءة معينة (FPKM). تم تعريف الجينات المخصبة بالبنكرياس الكبدي على أنها تلك الجينات التي لها مستويات تعبير أعلى (ص & lt 0.05) في كل من عينة "الغدة الهضمية" وعينة "الكبد والبنكرياس" التي تم جمعها حديثًا مقارنة بالأعضاء الأخرى (العضلة المقربة ، ملامس الشفوي ، الخياشيم ، الدم ، الوشاح ، الغدد التناسلية الذكرية ، والغدد التناسلية الأنثوية).

يبني البلازميد

لتوليد المسبار الريبي ، يتم تضخيم شظايا من cgPdx (489 نقطة أساس) ، cgMIP123 (608 نقطة أساس) ، cgMIP4 (679 نقطة أساس) ، cgMILP7 (359 نقطة أساس) و cgilp (332 نقطة أساس) في pGEM-T easy (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية). لتقييم التوطين الخلوي ، cgPdx تم تضخيم تسلسل الترميز مع الاشعال المحتوي على XhoI المواقع و ligated فيها XhoI- ناقل pEGFP-N1 المهضوم (Clontech ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوليد اندماج في الإطار باستخدام EGFP (بناء pEGFP-Pdx). لمقايسات لوسيفيراز ، بدون علامة mPdx1, cgPdx (LOC105327390 74) و cgNeuroD (LOC105336755 75) تم بناء البلازميدات عن طريق الاستنساخ في XhoI و أنا مواقع في متجه تعبير pSI (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية بناء pSI-mPdx1 ، pSI-cgPdx ، pSI-cgNeuroD). كما يبني مراسل يراع لوسيفيراز ، المناطق الجينومية المقابلة المنبع من cgilp تم ربطها بـ pGL4.23 [لوس 2/ minP] المتجه (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية تُنشئ pGL-B1). تم إنشاء ثلاثة إصدارات قصيرة (اثنان مع مواقع TAAT المعدلة) عن طريق الطفرات في المختبر (التركيبات pGL-B2 و pGL-B2M1 و pGL-B2M2 ، الشكل 4). تم إنشاء مواقع TAAT المعدلة من خلال تصميم قاعدة غير متطابقة في الاشعال التي تغطي المواقع. أعطيت الاشعال في البيانات التكميلية 4.

تخليق الجسم المضاد و ChIP-qPCR

تم استنساخ تسلسل تشفير الببتيد cgPdx 1–160 في ناقل pET-28a-SUMO ، وتم التعبير عنه في خلايا BL21 (DE3). تمت تنقية البروتين المؤتلف الموسوم SUMO عن طريق كروماتوجرافيا تقارب Ni-NTA (Qiagen) للأرنب المضاد لـ cgPdx متعدد الأضلاع ، E9112 و E9113 ، تم تطويره بواسطة Abclonal (ووهان ، الصين). تم إجراء التحقق من صحة الأجسام المضادة عن طريق النشاف الغربي على محلولات أنسجة المحار الكبدية (الشكل التكميلي 11). تم استنساخ تسلسل الترميز الكامل لـ cgPdx في الإطار (انظر البيانات التكميلية 4 للاشعال) بعلامة V5 في الطرف C (pSF-CMV-Puro-COOH-V5 ، Oxford Genetics) وتم التعبير عنها في خلايا HEK293T. ثم تم إجراء النشاف الغربي باستخدام محلول الخلية لتحديد الوزن الجزيئي لـ cgPdx. تم اختبار خصوصية الأجسام المضادة عن طريق النشاف الغربي على الجسم المضاد المضاد لـ PARP1 المحار الكبدى (ab32138 ، abcam ، شنغهاي ، الصين) كعنصر تحكم إيجابي. تم إجراء فحوصات ChIP وفقًا لبروتوكول قياسي (Abcam) مع تعديلات طفيفة. باختصار ، تم تشريح قطع أنسجة الكبد والبنكرياس المحار وتجميدها على النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم عزل الخلايا المفردة باستخدام الطرق الموصوفة لـ ATAC. تم ربط الخلايا المحصودة مع 1 ٪ فورمالدهيد لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ، وتم تحضين الكروماتين القابل للذوبان الذي تم الحصول عليه بعد صوتنة بأجسام مضادة لـ cgPdx. تم إجراء تجربتين ChIP مع أفراد مختلفين.

تم استخدام 150 ملغ من نسيج الكبد والبنكرياس مع 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة. تم استخدام البروتين A (Millipore ، 16-661) لترسيب المركبات المناعية للكروماتين ، والتي تم غسلها ثم تنقيتها باستخدام QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). تم تصميم الاشعال (البيانات التكميلية 4) لفحص qPCR الذي يستهدف مواقع ربط Pdx المحتملة المنبع ثلاثة جينات. ثم تم استخدام ChIP DNA كقالب لتحليل qPCR ، مع تطبيع النتائج عن طريق إدخال DNA. تم حساب تخصيب الطي وفقًا لطريقة "الإشارة فوق الخلفية" الشائعة (ThermoFisher). تم حساب أهمية متوسط ​​إثراء أضعاف الهدف إلى 1 بعينة واحدة ر-اختبار (من جانب واحد).

التهجين في الموقع

تم تصنيع المجسات التي تحمل علامات الديجوكسيجينين من التركيبات الخطية في اتجاهات المعنى ومضاد المعنى ، وتستخدم بالتوازي لجميع التجارب. تم تثبيت أنسجة الجسم الرخوة الكاملة من المحار اليافع (طول القشرة 1-3 سم) في بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ في برنامج تلفزيوني طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تم غسل الأنسجة مرتين في برنامج تلفزيوني ، وتم تجفيفها من خلال سلسلة كحول متدرجة قبل التخزين في 70 ٪ من الإيثانول عند -20 درجة مئوية. لتضمين الشمع ، تم غسل الأنسجة في 85٪ إيثانول (15 دقيقة) ، 100٪ إيثانول (3 × 15 دقيقة) ، ميثيل بنزوات (3 × 15 دقيقة) وبنزين (1 دقيقة) قبل نقلها إلى البارافين الذائب (3 × 30 دقيقة). ). تم تجميد الكتل عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل ، وتم تقليمها وتركيبها وتخزينها طوال الليل (4 درجات مئوية) قبل التقسيم عند 10 ميكرومتر. تم بعد ذلك إزالة الشمع من المقاطع بالزيلين ومعالجتها ببروتينيز K (1 ميكروغرام / مل ، 15 دقيقة) قبل التهجين (50٪ فورماميد منزوع الأيونات ، 5 × سترات صوديوم ملحية ، 0.1٪ توين -20 ، 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 0.3 مجم. / مل torula RNA ، 50 ميكروغرام / مل هيبارين) مع مسبار 50 نانوغرام / ميكرولتر عند 65 درجة مئوية ، طوال الليل. بعد الغسل باستخدام 0.2 × من سترات الصوديوم المالحة ومخزن حمض الماليك ، تم اكتشاف ريبوبروبس عن طريق الحضانة مع شظايا الفوسفاتاز القلوية المترافقة المضادة لـ DIG Fab (1: 4000 Roche Diagnostics ، الولايات المتحدة الأمريكية) في Roche blocking buffer في 100 ملي مولار من حمض الماليك (ساعتان ، درجة حرارة الغرفة). تم إجراء تطوير اللون عن طريق الحضانة في NBT / BCIP (US Biological ، Swampscott ، MA). تم غسل المقاطع بالماء المقطر ، وتركيبها في الجلسرين ، وفحصها باستخدام مجهر ضوئي Leica MZ10F بإذن من Microscope Services Ltd ، أكسفورد.

فحص Luciferase

تم زرع خلايا HeLa (ATCC ، الولايات المتحدة الأمريكية) و COS7 (التي قدمها الدكتور Qingfeng Yan ، جامعة Zhejiang ، Zhejiang ، الصين) في وسط RPMI-1640 المعدل (HyClone ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبنسلين - الستربتومايسين (سولاربيو ، الصين) ، في جو رطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. تم نقل البلازميدات إلى الخلايا باستخدام كاشف Lipofectamine 3000 (Life Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات المورد. أجريت فحوصات Luciferase في 24 لوحة جيدة مع

250000 خلية و 500 ميكرولتر وسط / بئر تم نقل ما مجموعه 0.5 ميكروغرام من DNA البلازميد للتعبير pSI (عن طريق إضافة نواقل pSI الفارغة للحفاظ على ثباتها لكل تعداء) مع 0.2 ميكروغرام من بلازميدات مراسل سلسلة pGL ، و 1 نانوغرام تحكم pRL-CMV Renilla لوسيفيراز بلازميد (بروميغا ، الولايات المتحدة الأمريكية). في 24 ساعة بعد الإصابة بالعدوى ، تم قياس أنشطة اليراع و Renilla luciferase باستخدام نظام الفحص المزدوج لوسيفيراز Reporter (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية) في قارئ Varioskan Flash متعدد الوسائط (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء كل تعداء في ثلاث نسخ للتكرارات البيولوجية ، وتم تقسيم الآبار إلى قسمين لإنشاء مكررات تقنية. تلاميذ ر تم استخدام الاختبار (على الوجهين) لتحديد أهمية الاختلافات. تم تقدير فاصل الثقة 95 ٪ (CI) من المجموع بين cgNeuroD و cgPdx / mPdx1 بناءً على مجموعة جميع التركيبات الممكنة بين قيم luciferase النسبية من مجموعات cgNeuroD و cgPdx / mPdx1. ثم تم حساب الأهمية عن طريق التمهيد (ن = 100،000) ، حيث تم أخذ عينات عشوائية من مجموع القيم بنفس حجم العينة مثل المجموعة (cgPdx / mPdx1 + cgNeuroD).

ملخص التقارير

يتوفر مزيد من المعلومات حول تصميم البحث في Nature Research Reporting Summary المرتبط بهذه المقالة.


Druker BJ و Talpaz M و Resta DJ و Peng B و Buchdunger E و Ford JM و Lydon NB و Kantarjian H و Capdeville R و Ohno-Jones S و Sawyers CL. فعالية وسلامة مثبط معين من BCR-ABL التيروزين كيناز في ابيضاض الدم النخاعي المزمن. إن إنجل جي ميد. 2001344: 1031-107.

Koivunen JP و Mermel C و Zejnullahu K و Murphy C و Lifshits E و Holmes AJ و Choi HG و Kim J و Chiang D و Thomas R et al. جين اندماج EML4-ALK وفعالية مثبط ALK kinase في سرطان الرئة. كلين كانسر ريس. 200814: 4275–83.

Storm EE و Durinck S و de Sousa e Melo F و Tremayne J و Kljavin N و Tan C و Ye X و Chiu C و Pham T و Hongo JA وآخرون. يعمل استهداف أورام القولون PTPRK-RSPO3 على تعزيز التمايز وفقدان وظيفة الخلايا الجذعية. طبيعة سجية. 2016529: 97-100.

Tomlins SA و Rhodes DR و Perner S و Dhanasekaran SM و Mehra R و Sun XW و Varambally S و Cao X و Tchinda J و Kuefer R et al. الانصهار المتكرر لجينات عامل النسخ TMPRSS2 و ETS في سرطان البروستاتا. علم. 2005310: 644-8.

يوشيهارا ك ، وانغ كيو ، توريس غارسيا دبليو ، زينج إس ، فيجيسنا آر ، كيم إتش ، فيرهاك آر جي. المنظر الطبيعي والأهمية العلاجية لعمليات اندماج النسخ المرتبطة بالسرطان. الأورام. 201534: 4845–54.

Mertens F ، Johansson B ، Fioretos T ، Mitelman F. التعقيد الناشئ للاندماج الجيني في السرطان. نات ريف السرطان. 201515: 371-81.

Kuppers R ، Dalla-Favera R. آليات الانتقال الكروموسومي في الأورام اللمفاوية للخلايا البائية. الأورام. 200120: 5580-94.

Davis CF ، Ricketts CJ ، Wang M ، Yang L ، Cherniack AD ، Shen H ، Buhay C ، Kang H ، Kim SC ، Fahey CC ، وآخرون. المشهد الجينومي الجسدي لسرطان الخلايا الكلوية الكروموفوبيا. الخلايا السرطانية. 201426: 319-30.

Vinagre J و Almeida A و Populo H و Batista R و Lyra J و Pinto V و Coelho R و Celestino R و Prazeres H و Lima L et al. تواتر طفرات محفز TERT في السرطانات البشرية. نات كومون. 20134: 2185.

Groschel S ، Sanders MA ، Hoogenboezem R ، de Wit E ، Bouwman BAM ، Erpelinck C ، van der Velden VHJ ، Havermans M ، Avellino R ، van Lom K ، et al. تؤدي إعادة ترتيب مُحسِّن سرطاني واحد إلى تحرير متزامن لـ EVI1 و GATA2 في اللوكيميا. زنزانة. 2014157: 369-81.

Zhang Y و Chen F و Fonseca NA و He Y و Fujita M و Nakagawa H و Zhang Z و Brazma A و Group PTW و Group PSVW وآخرون. يكشف تحليل الجينوم الكامل عالي التغطية لـ 1220 نوعًا من السرطان عن مئات الجينات التي تم تحريرها من خلال التعديلات التنظيمية التي تتم بوساطة إعادة ترتيب رابطة الدول المستقلة. نات كومون. 202011: 736.

Yang L و Luquette LJ و Gehlenborg N و Xi R و Haseley PS و Hsieh CH و Zhang C و Ren X و Protopopov A و Chin L et al. آليات متنوعة للتغيرات الهيكلية الجسدية في جينومات السرطان البشري. زنزانة. 2013153: 919–29.

Chen K و Wallis JW و McLellan MD و Larson DE و Kalicki JM و Pohl CS و McGrath SD و Wendl MC و Zhang Q و Locke DP وآخرون. BreakDancer: خوارزمية لرسم خرائط عالية الدقة للتنوع الهيكلي الجيني. طرق نات. 20096: 677-81.

Alaei-Mahabadi B ، Bhadury J ، Karlsson JW ، Nilsson JA ، Larsson E. التحليل العالمي للتغيرات الجينومية الهيكلية الجسدية وتأثيرها على التعبير الجيني في السرطانات البشرية المتنوعة. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016113: 13768–73.

Seshagiri S ، Stawiski EW ، Durinck S ، Modrusan Z ، Storm EE ، Conboy CB ، Chaudhuri S ، Guan Y ، Janakiraman V ، Jaiswal BS ، et al. اندماج R-spondin المتكرر في سرطان القولون. طبيعة سجية. 2012488: 660-4.

Stransky N ، Cerami E ، Schalm S ، Kim JL ، Lengauer C. منظر اندماج كيناز في السرطان. نات كومون. 20145: 4846.

Tomlins SA، Mehra R، Rhodes DR، Smith LR، Roulston D، Helgeson BE، Cao X، Wei JT، Rubin MA، Shah RB، Chinnaiyan AM. TMPRSS2: يحدد اندماج الجينات ETV4 نوعًا فرعيًا جزيئيًا ثالثًا من سرطان البروستاتا. الدقة السرطان. 200666: 3396-400.

Gao Q و Liang WW و Foltz SM و Mutharasu G و Jayasinghe RG و Cao S و Liao WW و Reynolds SM و Wyczalkowski MA و Yao L et al. اندماج المحرك وانعكاساته في تطوير وعلاج السرطانات البشرية. ممثل الخلية. 201823: 227–38 e223.

Zhang Y و Yang L و Kucherlapati M و Chen F و Hadjipanayis A و Pantazi A و Bristow CA و Lee EA و Mahadeshwar HS و Tang J وآخرون. خلاصة وافية لعموم السرطان من الجينات التي تم تحريرها من خلال إعادة ترتيب الجينوم الجسدي عبر أكثر من 1400 حالة. ممثل الخلية. 201824: 515–27.

Rao SS، Huntley MH، Durand NC، Stamenova EK، Bochkov ID، Robinson JT، Sanborn AL، Machol I، Omer AD، Lander ES، Aiden EL. تكشف خريطة ثلاثية الأبعاد للجينوم البشري بدقة Kilobase عن مبادئ حلقات الكروماتين. زنزانة. 2014159: 1665-1680.

Barros-Silva JD، Paulo P، Bakken AC، Cerveira N، Lovf M، Henrique R، Jeronimo C، Lothe RA، Skotheim RI، Teixeira MR. شركاء الاندماج الجديد 5 لـ ETV1 و ETV4 في سرطان البروستاتا. الأورام. 201315: 720-6.

أطلس جينوم السرطان ن. توصيف جزيئي شامل لسرطان القولون والمستقيم البشري. طبيعة سجية. 2012487: 330-7.

يوهانسن شبيبة ، كريستنسن آي جيه ، ريسبرو آر ، جرينال إم ، هان سي ، برايس بي إيه ، سميث ك ، برونر إن ، هاريس أل. يرتبط ارتفاع مستويات YKL-40 في مصل الدم لدى مرضى سرطان الثدي الأولي بفترة بقاء قصيرة خالية من التكرار. علاج سرطان الثدي. 200380: 15-21.

Cintin C، Johansen JS، Christensen IJ، Price PA، Sorensen S، Nielsen HJ. مصل YKL-40 وسرطان القولون والمستقيم. Br J السرطان. 199979: 1494-9.

Pelloski CE و Mahajan A و Maor M و Chang EL و Woo S و Gilbert M و Colman H و Yang H و Ledoux A و Blair H وآخرون. يرتبط تعبير YKL-40 باستجابة ضعيفة للإشعاع وبقاء إجمالي أقصر في الورم الأرومي الدبقي. كلين كانسر ريس. 200511: 3326–34.

Kang EJ و Jung H و Woo OH و Park KH و Woo SU و Yang DS و Kim AR و Lee JB و Kim YH و Kim JS و Seo JH. يمكن أن يكون تعبير YKL-40 علامة تنبؤية ضعيفة في أنسجة سرطان الثدي. ورم بيول. 201435: 277–86.

Padro M و Cobler L و Garrido M و de Bolos C. يؤدي التنظيم السفلي لـ FUT3 و FUT5 بواسطة shRNA إلى تغيير تعبير مستضدات لويس ويقلل من قدرات الالتصاق لخلايا سرطان المعدة. Biochim Biophys Acta. 18102011: 1141-119.

Liang L و Gao C و Li Y و Sun M و Xu J و Li H و Jia L و Zhao Y. miR-125a-3p / FUT5-FUT6 يتوسط تكاثر خلايا سرطان القولون والمستقيم والهجرة والغزو وتكوين الأوعية المرضية عبر PI3K-Akt مسار. ديس موت الخلية. 20178: e2968.

Potapenko IO و Luders T و Russnes HG و Helland A و Sorlie T و Kristensen VN و Nord S و Lingjaerde OC و Borresen-Dale AL و Haakensen VD. توقيعات التعبير الجيني المرتبطة بالجليكان في الأنواع الفرعية لسرطان الثدي فيما يتعلق بالبقاء على قيد الحياة. مول Oncol. 20159: 861–76.

Slebe F و Rojo F و Vinaixa M و Garcia-Rocha M و Testoni G و Guiu M و Planet E و Samino S و Arenas EJ و Beltran A وآخرون. يتحكم الليباز البطاني FoxA و LIPG في امتصاص الدهون خارج الخلية لنمو سرطان الثدي. نات كومون. 20167: 11199.

Rippe V، Drieschner N، Meiboom M، Murua Escobar H، Bonk U، Belge G، Bullerdiek J. تحديد الجين الذي أعيد ترتيبه بواسطة 2p21 الانحرافات في أورام الغدة الدرقية. الأورام. 200322: 6111-4.

أبحاث أطلس الجينوم السرطاني ن. التوصيف الجينومي المتكامل لسرطان الغدة الدرقية الحليمي. زنزانة. 2014159: 676-90.

Kloth L، Belge G، Burchardt K، Loeschke S، Wosniok W، Fu X، Nimzyk R، Mohamed SA، Drieschner N، Rippe V، Bullerdiek J. يعتبر الانخفاض في تعبير الغدة الدرقية المرتبط (THADA) علامة على عدم تمايز أنسجة الغدة الدرقية . بي إم سي كلين باثول. 201111: 13.

Panebianco F و Kelly LM و Liu P و Zhong S و Dacic S و Wang X و Singhi AD و Dhir R و Chiosea SI و Kuan SF وآخرون. اندماج THADA هو آلية لتنشيط IGF2BP3 وإشارات IGF1R في سرطان الغدة الدرقية. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017114: 2307-12.

بوجولد د ، مورايس دا ، غوتييه سي ، كوت سي ، كارون إم ، كوان تي ، تشين كيه سي ، لابيرلي جي ، ماركوفيتس إيه إن ، باستينين تي ، وآخرون. بوابة بيانات اتحاد إبيجينوم الإنسان الدولي. نظام الخلية. 20163: 496-9 e492.

كونسورتيوم EP. موسوعة متكاملة لعناصر الحمض النووي في الجينوم البشري. طبيعة سجية. 2012489: 57–74.

Hou H و Yu X و Cong P و Zhou Y و Xu Y و Jiang Y: Six2 يعزز جذوع الخلايا غير الصغيرة لسرطان الرئة من خلال E-cadherin منظمًا وراثيًا وجينيًا. بروليف الخلية. 201952: e12617.

وانج كا ، دراسين دي ، فام سي ، جيدليكا بي ، زابريزني V ، جوني إم ، لي إتش ، نيمينوف آر ، كوستيلو جي سي ، تان إيه سي ، فورد إتش إل. يشجع البروتين المثلي Six2 على ورم خبيث لسرطان الثدي عن طريق التحكم النسخي والجيني لتعبير E-cadherin. الدقة السرطان. 201474: 7357–70.

Wu DW، Lin PL، Wang L، Huang CC، Lee H. يعد محور YAP1 / SIX2 مطلوبًا لعدوانية الورم بوساطة DDX3 ومقاومة سيتوكسيماب في سرطان القولون والمستقيم من النوع البري KRAS. ثيرانوستيكس. 20177: 1114-1132.

Lederer M ، Bley N ، Schleifer C ، Huttelmaier S. دور بروتين رابط الورم IGF2 mRNA 3 (IGF2BP3) في السرطان. سيمين السرطان بيول. 201429: 3-12.

Kamburov A، Pentchev K، Galicka H، Wierling C، Lehrach H، Herwig R. ConsensusPathDB: نحو صورة أكثر اكتمالا لبيولوجيا الخلية. الدقة الأحماض النووية. 201139: D712–7.

اليوم E ، Poulogiannis G ، McCaughan F ، Mulholland S ، Arends MJ ، Ibrahim AE ، Dear PH. IRS2 مرشح للجينات الورمية للسائق في 13q34 في سرطان القولون والمستقيم. Int J أكسب باثول. 201394: 203-11.

Jia Y ، Xie Z ، Li H. الحمض النووي الريبي الوهمي المقسم وراثيًا في السرطان. اتجاهات السرطان. 20162: 475–84.

Matsumoto H، Koo SL، Dent R، Tan PH، Iqbal J. دور التسرب الالتهابي في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. ياء نوتر باثول. 201568: 506-10.

Yang L و Lee MS و Lu H و Oh DY و Kim YJ و Park D و Park G و Ren X و Bristow CA و Haseley PS وآخرون. تحليل إعادة ترتيب الجينوم الجسدي في السرطانات البشرية باستخدام تسلسل الإكسوم الكامل. أنا J Hum Genet. 201698: 843-56.

Wang K و Singh D و Zeng Z و Coleman SJ و Huang Y و Savich GL و He X و Mieczkowski P و Grimm SA و Perou CM وآخرون. MapSplice: رسم خرائط دقيق لقراءات RNA-seq لاكتشاف مفرق التوصيل. الدقة الأحماض النووية. 201038: e178.

Iyer MK، Chinnaiyan AM، Maher CA. ChimeraScan: أداة لتحديد النسخ الوهمي في تسلسل البيانات. المعلوماتية الحيوية. 201127: 2903-4.

ماكفرسون أ ، هرمزدياري إف ، زايد أ ، جولياني آر ، ها جي ، صن إم جي ، جريفيث إم ، هيرافي موسوي أ ، سينز جي ، ميلنيك إن ، وآخرون. deFuse: خوارزمية لاكتشاف اندماج الجينات في بيانات الورم RNA-Seq. بلوس كومبوت بيول. 20117: e1001138.

روبنسون جيه تي ، ثورفالدسدوتير إتش ، وينكلر دبليو ، جوتمان إم ، لاندر إس ، جيتز جي ، ميسيروف جي بي. عارض الجينوم التكاملي. Nat Biotechnol. 201129: 24-6.

سوبرامانيان أ ، تامايو ف ، موثا ف ك ، موخيرجي إس ، إيبرت بل ، جيليت إم إيه ، بولوفيتش أ ، بوميروي إس إل ، جولوب تي آر ، لاندر إس ، ميسيروف جي بي. تحليل تخصيب مجموعة الجينات: نهج قائم على المعرفة لتفسير ملامح التعبير على مستوى الجينوم. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005102: 15545–50.

تكشف خرائط الحرارة المعقدة Gu Z و Eils R و Schlesner M. عن أنماط وارتباطات في البيانات الجينومية متعددة الأبعاد. المعلوماتية الحيوية. 201632: 2847-9.

كانيسيوس إس ، مارتينز جي دبليو ، ويسيلز إل إف. يُظهر اختبار استقلالية جديدة للتغيرات الجسدية في السرطان أن البيولوجيا تقود التفرد المتبادل لكن الصدفة تفسر معظم التواجد المشترك. جينوم بيول. 201617: 261.

أطلس جينوم السرطان: قاعدة بيانات للأنماط الجينية والأنماط الظاهرية. تحميل المراجع


توافر البيانات والمواد

تتوفر مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها أثناء الدراسة الحالية كمشروع بيولوجي في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية تحت رقم الانضمام PRJNA616061 (https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA616061). أرابيدوبسيس مجموعات بيانات ميكروأري للتعبير الجيني النهاري الموضحة في الجدول 1 من المرجع [37] متاحة في ArrayExpress تحت رقم الانضمام E-MEXP-1304 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MEXP-1304/ ). تسلسل الحمض النووي المقابلة ل رابطة الدول المستقلةتم الحصول على الأشكال التنظيمية من إصدار قاعدة بيانات PLACE 30.0 (مكان الملفات. dat (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/place_dat.shtml) و place.seq (https: //www.dna. affrc.go.jp/PLACE/place_seq.shtml)). تم الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية البروتينية من إصدار Uniprot 2015.01 (ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/previous_releases/release-2015_01/). تم التنبؤ بنطاقات البروتين بناءً على الإصدار 6.1 من بروسايت (ftp://ftp.expasy.org/databases/prosite/old_releases/prosite06_1.tar.bz2) وإصدار Pfam 9.0 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub /databases/Pfam/releases/Pfam9.0/).

جينات / بروتينات Arabidopsis من مصدر معلومات Arabidopsis (https://www.arabidopsis.org) ، إصدار التعليق التوضيحي TAIR10 (الاسم (رقم تعريف الجين الفريد Uniprot)): LHY (AT1G01060 Q6R0H1) ، CCA1 (AT2G46830 P92973) ، RVE1 ( AT5G17300 F4KGY6)، RVE2 (AT5G37260 F4K5X6)، RVE4 (AT5G02840 Q6R0G4)، RVE5 (AT4G01280 C0SVG5)، RVE6 (AT5G52660 Q8H0W3)، RVE7 (AT1G18330 B3H5A8)، RVE8 (AT3G09600 Q8RWU3)، TOC1 / PRR1 (AT5G61380 Q9LKL2)، PRR3 ( AT5G60100 F4JXG7)، PRR4 (AT5G49240 Q9FJ16)، PRR5 (AT5G24470 Q6LA42)، PRR7 (AT5G02810 Q93WK5)، PRR9 (AT2G46790 Q8L500)، GI (AT1G22770 Q9FQ280) )، EF4L2 (AT1G72630 Q94BS8)، EF4L3 (AT2G06255 Q8S8F5)، ​​EF4L4 (AT1G17455 Q570U6)، LUX) / PCL1 (AT3G46640 F4J959)، BOA (AT5G59570 F4J959O) ، FKF1 / ADO3 (AT1G68050 Q9C9W9).

جينات / بروتينات من MaizeGDB (https://maizegdb.org/) لإصدار شرح الذرة 5b ، ومن Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/) لإصدار شرح الذرة الرفيعة v3.1 وإصدار شرح الدخن الثعلب v2.2 (الاسم (معرّف الجين الفريد للذرة والذرة الرفيعة والذيل الثعلب): LYL1 (GRMZM2G175227 + GRMZM2G175265 + GRMZM2G474769 Sobic.007G047400 Seita.6G055700) ، LYL2 (GRMZM2G014G02 Sobic. 4G288100)، RE6L1 (GRMZM2G135052 Sobic.010G004300 Seita.4G004600)، RE6L2 (GRMZM2G170148 Sobic.010G223700 Seita.4G266800)، RE6L3 (GRMZM2G057408 Sobic.010G223700 Seita.4G266800)، RE6L4 (GRMZM5G833032 Sobic.004G281800 Seita.1G272700)، RE6L5 (GRMZM2G118693 Sobic.004G281800 Seita. 7G212900) ، RE8L2 (GRMZM2G115070 Sobic.001G143100 ، Si038786m) RE8L1 (GRMZM2G415077 Sobic.001G143100 Si038786m)، T1L1 (GRMZM2G148453 Sobic.004G216700 Seita.1G236100)، T1L2 (GRMZM2G020081 Sobic.004G216700 Seita.1G236100)، P37L1 (GRMZM2G005732 Sobic.006G057900 Seita.2G444300)، P37L2 (GRMZM2G033962 Sobic.006G057900 Seita.2G444300)، P59L2 (GRMZM2G488465 + GRMZM2G013913 Sobic.005G044400 Seita.8G040100)، P59L1 (GRMZM2G135446 Sobic.005G044400 Seita.8G040100)، P73L (GRMZM2G095727 Sobic.001G411400 Seita.9G445200)، P95L1 (GRMZM2G179024 Sobic.002G275100 Seita.2G286100) ، P95L2 (GRMZM2G367834 Sobic. Sobic.009G257300 Seita. 2G 195800) ، LXL (GRMZM2G067702 Sobic.003G443600 Seita.5G468100) ، ZLL1 (GRMZM2G115914 Sobic.010G243900 Seita.4G249100) ، ZLL2 (GRMZM2G113244 سوبيك. Sobic.004G042200 Seita.1G087300) ، FFL1 (GRMZM2G106363 ، Sobic.005G145300 Seita.8G146900) ، FFL2 (GRMZM2G107945 Sobic.005G145300 Seita.8G146900).


أساليب

المواد وعلاجات الإجهاد

ال ب. رابا تم زرع الصنف Chiffu في غرفة نمو في معهد أبحاث المحاصيل الزيتية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية في ووهان عند درجة حرارة 20 ± 2 درجة مئوية مع إضاءة 12 ساعة و 12 ساعة مظلمة. تم أخذ عينات من الجذور من الشتلات الصغيرة. تم الحصول على براعم الزهور الطازجة ، وأخذت عينات من الأنسجة الأخرى بعد حوالي 25 يومًا من الإزهار ، بما في ذلك السيقان والأوراق والسيليك والبذور. تم تحضير ثلاث مكررات بيولوجية لكل نسيج تم اختباره عن طريق جمع عينات من ثلاثة أفراد مختلفين. تم تجميد العينات بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي.

أ ب. رابا تم استخدام الأرض (Wuxianzangcaizi) في معالجة المعادن الثقيلة. تم تعقيم البذور الصحية ذات الأحجام المتشابهة وتجفيفها ثم إنباتها في ورق ترشيح رطب معقم. تمت معالجة البذور بوسط طازج مكمل بـ 20 مل 15 مجم / لتر CdCl2 أو 50 مجم / لتر Pb (NO3)2 [36]. عملت البذور المعالجة بكمية متساوية من الماء المقطر كعناصر تحكم. تم استخدام ثلاث مكررات من 50 بذرة لكل معاملة. تمت زراعة بذور المعاملة والسيطرة في الظلام لمدة 24 ساعة عند 22 درجة مئوية ثم تم تربيتها خلال فترة الضوء (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات دورة مظلمة) لمدة سبعة أيام. تم حصاد البراعم والجذور من الشتلات ذات الأحجام المتشابهة بشكل منفصل وغسلها ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. تم تجميد العينات في النيتروجين السائل حتى استخراج الحمض النووي الريبي.

تحديد وتحليل بروتينات الجليوكسالاز في ب. رابا

تم استخدام مدخلات Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) PF00903 لـ GLYI و PF00753 لـ GLYII للبحث عن نموذج ماركوف المخفي (HMM) [34]. التسلسل الجينومي الكامل لـ ب. رابا تم الحصول عليها من براسيكا قاعدة بيانات (BRAD، http://brassicadb.org/brad/) [35]. ال GLYI و GLYII تم استخراج الجينات من التسلسل الجيني بأكمله وفقًا للأوصاف التي قدمها Wang et al. [37].

تحليلات مواقع الكروموسومات وهياكل الجينات وتضاعف الجينات في برجلي و BrGlyII الجينات

المواقف الجينومية لل برجلي و BrGlyII على الجينات ب. رابا تم تحليل الكروموسومات باستخدام بحث بلاستن. ال برجلي و BrGlyII تم تحليل الهياكل الجينية باستخدام برنامج خادم عرض بنية الجينات (GSDS ، http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php) [38]. ازدواجية برجلي و BrGlyII وقورنت مواقفهم بين أرابيدوبسيس و ب. رابا الجينومات الفرعية كما هو موضح سابقًا [39].

تحليل المتواليات وبناء شجرة النشوء والتطور

تم استخدام برنامج Clustal X (ftp://ftp-igbrmc.u-strasbg.fr/pub/clustalX/) لمحاذاة الأحماض الأمينية (aa). تم إنشاء التحليل الوراثي باستخدام برنامج MEGA 5.05 باستخدام طريقة ربط الجوار (NJ) و 1000 اختبار تمهيد [40].

توطين الخلايا الفرعية لبروتينات GLYI المتوقعة

تم تحليل المواضع الخلوية الفرعية لجميع بروتينات BrGLYI و BrGLYII المتوقعة باستخدام أدوات مختلفة عبر الإنترنت ، مثل Wolf pSORT [41] و TargeP و ChloroP [42].

تحليل تسلسل المروج

لتحليل العناصر التنظيمية في برجلي و BrGlyII المروجين ، تم الحصول على تسلسل 1.5 كيلو بايت 5-upstream من كود بدء ATG من BRAD ، وتم تحليلها باستخدام قواعد بيانات PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) [40 ، 43] .

تحليل التعبير الجيني

ال برجلي تم تحليل التعبير في أنسجة الجذر والساق والأوراق والزهور والسيليك من الملفوف الصيني البالغ من العمر 7 أسابيع والكالس (Chiifu-401-42) باستخدام بيانات النسخ على الإنترنت (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi؟acc=GSE43245) [44]. تم استخدام البيانات لإنشاء خريطة حرارية باستخدام حزمة Heat map Illustrator (HemI، http://hemi.biocuckoo.org/down.php) [45].

للكشف عن رد برجلي الجينات إلى الإجهاد الحيوي في الملفوف الصيني ، والتعبير عن الجميع برجلي و BrGlyII تم تحليل الجينات استجابة لعدوى الممرض باستخدام بيانات RNA-seq المبلغ عنها (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE74044) [46].

تم استخدام البيانات الأولية التي تم الحصول عليها باستخدام نهج تسلسل النسخ المستند إلى العلامات لتأكيد استجابة برجلي جينات الإجهاد المعدني الثقيل ، والتي يمكن الوصول إليها من خلال قاعدة بيانات GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE55264) [47].

تحليلات RT-qPCR

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عزل (BioTeke ، RP3201). تم تصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة التوليف (TransGen Biotech) ، وتم تنفيذ RT-qPCR كما وصفه Li et al. [39]. التعبير النسبي عن برجلي تم تحليله باستخدام أكتين كجينات تدبير منزلي باستخدام طريقة موصوفة سابقًا [48]. البادئات المحددة المصممة مدرجة في جدول S1.


الاتجاهات المستقبلية والتأثيرات السريرية

يختلف مثيلة الحمض النووي ليس فقط بين الأنسجة ولكن أيضًا بين مناطق الدماغ ، وبين المادة الرمادية والمادة البيضاء ، وربما حتى بين الخلايا (Ladd-Acosta وآخرون، 2007 غوش وآخرون، 2010). على الرغم من أن التكنولوجيا الحالية تحد من قدرتنا على التمييز بين أنماط المثيلة الخاصة بالخلية ، فإن ظهور الجيل التالي من تسلسل الحمض النووي قد وفر أدوات قوية لفحص نمط مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم بدقة النوكليوتيدات المفردة (Meissner وآخرون، 2008 ليستر وآخرون، 2009 بوب وآخرون، 2010). مع تحسن التكنولوجيا ، ستنخفض تكلفة إجراء تحليل التسلسل ، مما يجعل الوصول إلى التكنولوجيا أكثر سهولة. سمحت التطورات التقنية الأخيرة بإجراء تحليل مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم حتى مع عينة منخفضة تصل إلى 150 & # x02009ng (Popp وآخرون، 2010). لوحظت أنماط مثيلة الحمض النووي الشاذة في مجموعة متنوعة من الأمراض النفسية والعصبية. مع انخفاض التكاليف والقدرة على إجراء تحليل مثيلة على مستوى الجينوم بكميات محدودة من الأنسجة ، سيكون من الممكن قريبًا تحديد أنماط مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم من مناطق دماغية متميزة من مرضى يعانون من اضطرابات عصبية ونفسية. سيؤدي تحليل الأنسجة العصبية من المرضى النفسيين إلى رؤى جديدة في مسببات الأمراض النفسية وفتح آفاق جديدة لاكتشاف الأدوية والعلاجات المستهدفة.

على الرغم من أن البروتوكولات الحالية تمكن العلماء من التحديد الكمي الدقيق لميثيل الحمض النووي بدقة أحادية النوكليوتيدات باستخدام كميات أنسجة أصغر تدريجيًا ، فإن العديد من الطرق الأكثر شيوعًا لتحديد سمات مثيلة الحمض النووي وتحديدها الكمي ، مثل تسلسل ثنائي سلفيت والمقايسات المستندة إلى الإنزيم الحساس للميثيل ، هي غير قادر على التمييز بين 5hmC و 5mC (Tahiliani وآخرون، 2009 هوانغ وآخرون، 2010). هناك عدد قليل من البروتوكولات قادرة على التمييز بين 5hmC و 5mC في الجينوم: وسم نهاية CpG متبوعًا بكروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة (Tahiliani وآخرون، 2009) والكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية (Liutkeviciute وآخرون، 2009) أو مقياس الطيف الكتلي الترادفي (Globisch وآخرون، 2010 لو وآخرون، 2011). يمكن إثراء الحمض النووي الهيدروكسي ميثيل باستخدام الأجسام المضادة التي ترتبط على وجه التحديد بـ 5hmC أو عن طريق التحويل الحيوي لـ 5hmC المعدلة ويمكن التعرف على التسلسلات المترسبة باستخدام شرائح ميكروأري أو عن طريق تسلسل الحمض النووي (Szwagierczak وآخرون، 2010 فيكز وآخرون، 2011 جين وآخرون، 2011 القس وآخرون، 2011 Wu and Zhang، 2011). على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن تحدد مقدار 5hmC وتحدد تسلسل الحمض النووي المرتبط بها ، إلا أن دقة زوج القاعدة الفردي لم يتم تحقيقها. من أجل توضيح التوزيع الجيني والدور اللاجيني لـ 5hmC في الدماغ ، يجب تطوير طريقة خاصة بالموقع لتحديد 5hmC.

نظرًا لأن التقنيات الأخرى عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي والترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، أصبحت أكثر سهولة للباحثين ، فهناك حاجة متزايدة لدمج البيانات عالية الإنتاجية. حاليًا ، تتم دراسة مثيلة الحمض النووي ، وتعديل هيستون ، و miRNA في عزلة نسبية. من أجل فهم كامل لكيفية تنظيم التعبير الجيني داخل الجهاز العصبي ، يجب أن تنظر الأبحاث المستقبلية في الإبيجينوم ككل. من خلال تشريح الآليات البيولوجية التي تتوسط الحديث المتبادل بين هذه الآليات البيولوجية ودمج البيانات عالية الإنتاجية ، يمكننا البدء في دراسة الإبيجينوم ككل. أخيرًا ، من أجل فهم كامل لكيفية تنظيم الإيبيجينوم للتعبير الجيني ، سيتعين على البحث المستقبلي الكشف عن الآليات البيولوجية التي تتوسط التغيرات المعتمدة على النشاط في المشهد اللاجيني لدماغ الثدييات.


شاهد الفيديو: فكرة التعبير الجيني (أغسطس 2022).